שיעור #5
DNA-פולימראז-2 מעורב בתהליכי תיקון DNA.
ככל שהטלומר (הרצף בקצה הDNA) ארוך יותר, כך התאים יכולים להתחלק יותר פעמים.
אצל בני אדם רצף הטלומר נראה כך: TTAGGG. אצל יצורים אחרים הרצף שונה מעט, אך קיים דמיון.
במשך שנים רבות הייתה הנחה שוירוסים מסויימים יכולים לגרום לסרטן ע"י שיבוש חלוקה של תאים.
החומר התורשתי של הוירוסים הללו היה RNA חד-גדילי, והחוקרים לא הבינו איך וירוסים משבשים פעילות DNA בתאים של בני אדם ואיך הגנום שלהם עובר אינטגרציה עם זה שלנו.
חוקר בריטי טען שהצליח לבודד אנזים שמסוגל לבצע פעולה הפוכה בוירוסים אלו - הפיכת RNA לDNA. לאנזים הזה קוראים DNA-Reverse-Transcriptase.
בקצוות הRNA יש רצפים משלימים. בשלב הראשון, אנזים משתמש במולקולת tRNA כפריימר כדי להשלים את הקטע החסר על לקצה של הגנום הלינארי.
בשלב הבא, האמזים RNAse-H מפרק RNA שנמצא בזיווג עם נוקליאוטידים משלימים עם מולקולת DNA. מוצר DNA ללא גדיל משלים, והוא עובר התעגלות. מתקבל מבנה של RNA ויראלי, עם DNA שיוכל לעבור הכפלה.
בעזרת יצירת גדיל נוסף יתקבל DNA משלים, וכך נוצר DNA דו גדילי שיכול לעבור מהוירס לגרעין התא של האורגניזם, ואף יכול לעבור אינטגרציה עם הגנום של הנדבק.
אצל נשא, ביטוי הDNA אינו גורם למחלה באופן ישיר.
פרק 25 בספר הלימוד - ארגון מחדש של האינפורמציה בDNA
אפיגנטיקה - נושא העוסק במידע נוסף, מעבר לזה שנמצע ברצף הנוקליאוטידים.
DNA מסוגל לעבור מתילציה - דבר הגורם לתא להתייחס לאינפורמציה בגן בצורה שונה.
חלבונים של כרומטין גם יכולים לבקר את האינפורמציה שמקודדת ע"י הDNA.
להלן מספר מושגים חשובים:
מודיפיקציה - שינויים אפיגנטים של הDNA.
רקומבינציה - שחלוף. במיוזה המתרחשת בתאי מין יש שחלוף מידע בין שני תאים ליצירת DNA שונה.
אמפליקציה - קטעים של DNA המוכפלים הרבה פעמים.
ארגון מחדש (Rearrangement) - קשור ליכולתו של הגוף ליצור נוגדים נגד כמעט כל פולש.
מתילציה - קישור קביצת מתיל לDNA. יכולה להתרחש רק לאחר שמולקולת DNA נוצרה.
מתילאזות - אנזימים שקושרים מתיל לDNA.
אצל חיידקים, המתילציה מתרחשת על החנקן שקשור לפחמן 6 של מולקולת האדנין. מולקולת המתיל נקשרת רק לאחר שהDNA נוצר. החנקן שקשור לפחמן 4 (מתיל ציטוזין) גם עובר מתילציה.
מתילציות מסוג זה נפוצות\ידועות אצל חיידקים והן נחשבות נורמליות או פיזיולוגיות.
המתילאזות מעורבות בתהליכי תיקון DNA. חלק ממנגנון התיקון של השברים בDNA קשור לתהליך מתילציה, בעיקר על אדנין. המתילציה גם מעורבת בתהליך תיקון DNA ובבקרה על השכפול והשעתוק. אצל חיידקים תהליך זה מגן על חיידק מפני פולשים, כמו וירוסים. במקרים מסויימים, חיידק הסלמונלה למשל, מתילציה גורמת לו להיות אלים יותר.
לגבי תאים אאוקריוטים - הנוקליאוטיד היחיד שעובר מתילציה במצב פיזיולוגי הוא הציטוזין. 5-מתיל-ציטוזין, על פחמן 5. בתאים של יונקים, ציטוזין שעבר מתילציה נמצא 5' לשייר של גואנין (G), כלומר, G נמצא מייד אחריו.
בתאים צמחיים הרצף יהיה:
תבנית המתילציה של DNA נשמרת גם לאחר חלוקת התא. לאחר הכפלת הDNA, מתילאזות מוסיפות את המתיל על הגדיל המשלים במקום בו הייתה מתילציה לפני ההכפלה.
יש גנים שבהתפתחות העוברית מבוטאים ברמה גבוהה, אך לאחר הלידה הם מושתקים עד יומו האחרון של האורגניזם.
המוגלובין עוברי למשל, מפסיק להווצר לאחר הלידה ובמקומו מתחיל להווצר המוגלובין אחר.
5-Azacytozine הוא ציטוזין שלא יכול לעבור מתילציה, אך פרט לעובדה זו הוא זהה לציטוזין רגיל.
אם ההשתקה היא בגלל מתילציה, לאחר מספר חלוקות לא נצטרך יותר להשתמש בו, ואם הגן היה מופעל אז נדע שהמתילציה היא זו שגרמה להשתקה.
באמת ראו שהגנים שחשבו שמעורבים בבקרה של ביטוי החלו להתבטא, וכך אנו יודעים שמתילציה מעורבת בבקרת ביטוי של גנים.
האנזים מתילאז לוקח את קבוצת המתיל מהמולקולה Adomet ומלביש אותה על הציטוזין.
Genetic Imprinting - תהליך שבו אלל שמועבר מאחד ההורים יהיה משותק ע"י מתילציה, והאלל מההורה האחר יהיה פעיל.
בגמטות של זכר, יש מצב של דמטילציה - למרות שהאלל האימהי ממותל, בגמטות יש תהליך של הסרת המתיל, ולכן כל תא זרע שהזכר יתרום יהיה לא ממותל, והאלל הלא ממותל יהיה פעיל בדור הבא. אצל הנקבה המקרה הפוך.
קיים גם תהליך Imprinting הפוך, שבו האלל של האב מושתק, והאלל של האם מבוטא.
אם על גבי צלחת חיידקים נוסיף בקטריופאג'ים בכמות קטנה, כעבור זמן מה נקבל "פלאקים" - אזורים ריקים בתוך מרבד חיידקים. הפלאקים הם למעשה אזורים שבהם החייקים עברו ליזיס (פירוק).
Arber לקח בקטריופאג' וחיידקי E-Coli, ולקח חיידקים מתוך הפלאק והדביק אותם בצלחת חדשה.
חיידקים מזן B ידעו להתגונן מפני הפאג'ים, ואילו חיידקים מזן K הודבקו ע"י הבקטריופאג'.
לפי סוג החיידקים נוצרו פלאקים ברמות שונות, ומכך הסיק Arber שלחיידק יש מנגנון הגנה מפני פולשים חיצוניים.
אנדונוקליאזות (נקראים גם "אנזימי רסטריקציה" - מפרקים DNA) מזהים רצפים ספציפים, למשל, רצף GAATTC יפורק ע"י החיידק.
על הDNA העצמי של החיידק הוא מגן בעזרת מתילציה. אם חלה טעות והחיידק גורם לוירוס מתילציה, הוירוס יהיה עמיד בפני האנדונוקליאזות.
אנזימים אלו, מגבילים את הDNA שיכול להיות בתוך התא. הם יצרו מהפכה במחקר הביולוגי - חלק גדול מההנדסה הגנטית מבוססת על התגלית שלהם.
בעזרת האנזים ECO-R1 אפשר לחתוך פלסמיד האזור מסויים. לפני מספר שנים השתמשו באינסולין של חזירים כדי להזריק לחולי סוכרת, אך זה לא תמיד עבד, ולעתים אף גרם למוות.
בעזרת אנזים זה, ניתן לחתוך גן של אינסולין במקום שמייצר אינסולין וכך להעביר אותו לבני אדם חולי סוכרת.
הטכנולוגיה של שימוש באנזימי רסטריקציה היא הבסיס להנדסה גנטית!
לכל אנזים רסטריקציה יש רצף DNA שהוא מכיר. יש גם אנזימים כאלו שמכירים רצפים המכילים מתיל.
ככל שהטלומר (הרצף בקצה הDNA) ארוך יותר, כך התאים יכולים להתחלק יותר פעמים.
אצל בני אדם רצף הטלומר נראה כך: TTAGGG. אצל יצורים אחרים הרצף שונה מעט, אך קיים דמיון.
במשך שנים רבות הייתה הנחה שוירוסים מסויימים יכולים לגרום לסרטן ע"י שיבוש חלוקה של תאים.
החומר התורשתי של הוירוסים הללו היה RNA חד-גדילי, והחוקרים לא הבינו איך וירוסים משבשים פעילות DNA בתאים של בני אדם ואיך הגנום שלהם עובר אינטגרציה עם זה שלנו.
חוקר בריטי טען שהצליח לבודד אנזים שמסוגל לבצע פעולה הפוכה בוירוסים אלו - הפיכת RNA לDNA. לאנזים הזה קוראים DNA-Reverse-Transcriptase.
בקצוות הRNA יש רצפים משלימים. בשלב הראשון, אנזים משתמש במולקולת tRNA כפריימר כדי להשלים את הקטע החסר על לקצה של הגנום הלינארי.
בשלב הבא, האמזים RNAse-H מפרק RNA שנמצא בזיווג עם נוקליאוטידים משלימים עם מולקולת DNA. מוצר DNA ללא גדיל משלים, והוא עובר התעגלות. מתקבל מבנה של RNA ויראלי, עם DNA שיוכל לעבור הכפלה.
בעזרת יצירת גדיל נוסף יתקבל DNA משלים, וכך נוצר DNA דו גדילי שיכול לעבור מהוירס לגרעין התא של האורגניזם, ואף יכול לעבור אינטגרציה עם הגנום של הנדבק.
אצל נשא, ביטוי הDNA אינו גורם למחלה באופן ישיר.
פרק 25 בספר הלימוד - ארגון מחדש של האינפורמציה בDNA
אפיגנטיקה - נושא העוסק במידע נוסף, מעבר לזה שנמצע ברצף הנוקליאוטידים.
DNA מסוגל לעבור מתילציה - דבר הגורם לתא להתייחס לאינפורמציה בגן בצורה שונה.
חלבונים של כרומטין גם יכולים לבקר את האינפורמציה שמקודדת ע"י הDNA.
להלן מספר מושגים חשובים:
מודיפיקציה - שינויים אפיגנטים של הDNA.
רקומבינציה - שחלוף. במיוזה המתרחשת בתאי מין יש שחלוף מידע בין שני תאים ליצירת DNA שונה.
אמפליקציה - קטעים של DNA המוכפלים הרבה פעמים.
ארגון מחדש (Rearrangement) - קשור ליכולתו של הגוף ליצור נוגדים נגד כמעט כל פולש.
מתילציה - קישור קביצת מתיל לDNA. יכולה להתרחש רק לאחר שמולקולת DNA נוצרה.
מתילאזות - אנזימים שקושרים מתיל לDNA.
אצל חיידקים, המתילציה מתרחשת על החנקן שקשור לפחמן 6 של מולקולת האדנין. מולקולת המתיל נקשרת רק לאחר שהDNA נוצר. החנקן שקשור לפחמן 4 (מתיל ציטוזין) גם עובר מתילציה.
מתילציות מסוג זה נפוצות\ידועות אצל חיידקים והן נחשבות נורמליות או פיזיולוגיות.
המתילאזות מעורבות בתהליכי תיקון DNA. חלק ממנגנון התיקון של השברים בDNA קשור לתהליך מתילציה, בעיקר על אדנין. המתילציה גם מעורבת בתהליך תיקון DNA ובבקרה על השכפול והשעתוק. אצל חיידקים תהליך זה מגן על חיידק מפני פולשים, כמו וירוסים. במקרים מסויימים, חיידק הסלמונלה למשל, מתילציה גורמת לו להיות אלים יותר.
לגבי תאים אאוקריוטים - הנוקליאוטיד היחיד שעובר מתילציה במצב פיזיולוגי הוא הציטוזין. 5-מתיל-ציטוזין, על פחמן 5. בתאים של יונקים, ציטוזין שעבר מתילציה נמצא 5' לשייר של גואנין (G), כלומר, G נמצא מייד אחריו.
בתאים אנימליים:
P מסמן את הפוספט של הגואנין.DNA String: '3 CpG '5
בתאים צמחיים הרצף יהיה:
DNA String: '3 CpNpG '5
N מסמן נוקליאוטיד כלשהו (לא משנה איזה נוקליאוטיד)תבנית המתילציה של DNA נשמרת גם לאחר חלוקת התא. לאחר הכפלת הDNA, מתילאזות מוסיפות את המתיל על הגדיל המשלים במקום בו הייתה מתילציה לפני ההכפלה.
יש גנים שבהתפתחות העוברית מבוטאים ברמה גבוהה, אך לאחר הלידה הם מושתקים עד יומו האחרון של האורגניזם.
המוגלובין עוברי למשל, מפסיק להווצר לאחר הלידה ובמקומו מתחיל להווצר המוגלובין אחר.
5-Azacytozine הוא ציטוזין שלא יכול לעבור מתילציה, אך פרט לעובדה זו הוא זהה לציטוזין רגיל.
אם ההשתקה היא בגלל מתילציה, לאחר מספר חלוקות לא נצטרך יותר להשתמש בו, ואם הגן היה מופעל אז נדע שהמתילציה היא זו שגרמה להשתקה.
באמת ראו שהגנים שחשבו שמעורבים בבקרה של ביטוי החלו להתבטא, וכך אנו יודעים שמתילציה מעורבת בבקרת ביטוי של גנים.
האנזים מתילאז לוקח את קבוצת המתיל מהמולקולה Adomet ומלביש אותה על הציטוזין.
Genetic Imprinting - תהליך שבו אלל שמועבר מאחד ההורים יהיה משותק ע"י מתילציה, והאלל מההורה האחר יהיה פעיל.
בגמטות של זכר, יש מצב של דמטילציה - למרות שהאלל האימהי ממותל, בגמטות יש תהליך של הסרת המתיל, ולכן כל תא זרע שהזכר יתרום יהיה לא ממותל, והאלל הלא ממותל יהיה פעיל בדור הבא. אצל הנקבה המקרה הפוך.
קיים גם תהליך Imprinting הפוך, שבו האלל של האב מושתק, והאלל של האם מבוטא.
אם על גבי צלחת חיידקים נוסיף בקטריופאג'ים בכמות קטנה, כעבור זמן מה נקבל "פלאקים" - אזורים ריקים בתוך מרבד חיידקים. הפלאקים הם למעשה אזורים שבהם החייקים עברו ליזיס (פירוק).
Arber לקח בקטריופאג' וחיידקי E-Coli, ולקח חיידקים מתוך הפלאק והדביק אותם בצלחת חדשה.
חיידקים מזן B ידעו להתגונן מפני הפאג'ים, ואילו חיידקים מזן K הודבקו ע"י הבקטריופאג'.
לפי סוג החיידקים נוצרו פלאקים ברמות שונות, ומכך הסיק Arber שלחיידק יש מנגנון הגנה מפני פולשים חיצוניים.
אנדונוקליאזות (נקראים גם "אנזימי רסטריקציה" - מפרקים DNA) מזהים רצפים ספציפים, למשל, רצף GAATTC יפורק ע"י החיידק.
על הDNA העצמי של החיידק הוא מגן בעזרת מתילציה. אם חלה טעות והחיידק גורם לוירוס מתילציה, הוירוס יהיה עמיד בפני האנדונוקליאזות.
אנזימים אלו, מגבילים את הDNA שיכול להיות בתוך התא. הם יצרו מהפכה במחקר הביולוגי - חלק גדול מההנדסה הגנטית מבוססת על התגלית שלהם.
בעזרת האנזים ECO-R1 אפשר לחתוך פלסמיד האזור מסויים. לפני מספר שנים השתמשו באינסולין של חזירים כדי להזריק לחולי סוכרת, אך זה לא תמיד עבד, ולעתים אף גרם למוות.
בעזרת אנזים זה, ניתן לחתוך גן של אינסולין במקום שמייצר אינסולין וכך להעביר אותו לבני אדם חולי סוכרת.
הטכנולוגיה של שימוש באנזימי רסטריקציה היא הבסיס להנדסה גנטית!
לכל אנזים רסטריקציה יש רצף DNA שהוא מכיר. יש גם אנזימים כאלו שמכירים רצפים המכילים מתיל.
