שיעור #3
DNA יכול להמצא בצורת ADNA, BDNA ו-ZDNA. מולקולה היברידית (מורכבת מRNA ו-DNA) תהיה בצורת ADNA ותמצא בסביבה מיימית. מבנה של BDNA מתאפשר כאשר החמצן על גבי פחמן 2 חסר. מבנה הZDNA מאופיין ע"י סיבוב הפוך (שמאלי), והפורינים שלו במצב SIN במקום ANTI, מה שמאפשר מתילציה היעילות גדולה יותר. בצורת ה HDNA, ניתן לקבל סליל משולש, או תלת-גדילי. הסיבה לכך ששני הגדילים של הDNA נשארים צמודים זה לזה היא שה-ΔH גדל טובת דנטורציה. ובכל זאת, יש לנו קשרי מימן שתורמים ΔH גדול יותר, מה שגורם ל ΔG להיות חיובי. קשרי המימן הם אלו שמייצבים את המבנה הדו-גדילי בשתי דרכים:
- העלאת הטמפרטורה תורמת ל ΔG שלילי. היא יכולה לגרום להפרדה בין שני הגדילים, ומתוך כך לדנטורציה.
- הקטנת החוזק היוני של התמיסה או הוצאת המלח מהתמיסה תתרום לדנטורציה מכיוון שפרמטר הדחייה יגדל.
שכפול DNA
הDNA בגרעין יכול לעבור שכפול ע"י הפרדת הגדילים (הכפלה קונסרטיבית), שעתוק לmRNA, t-RNA או מיקרו-RNA. יצירת המולקולות RNA על בסיס הDNA נקראת שעתוק או תעתוק (Transcription).
מולקולות אלו יוצאות מגרעין התא לציטופלסמה. במהלך השעתוק נוצרות מולקולות RNA, כאשר כיווניות יצירת הRNA היא תמיד מכיוון קצה 5' לכיוון 3' - הנוקליאוטיד החדש תמיד יתווסף בקצה של 3'.
הRNA-פולימראז פותח את הסליל הכפול, וריבונוקליאוטידים מתווספים עד שמולקולות הmRNA והtRNA יורדות. בסוף, מולקולת הmRNA יוצאת לציטופלסמה ומתורגמת לחלבון.
הריבוזום סורק את מולקולת ה mRNA עד שמגיע לקודון ההתחלה "AUG". אז מגיע tRNA עם חומצה אמינית אחרת מתאימה לבניית החלבון. החלבון תמיד נוצר מהקצה הN-טרמינלי לכיוון הקצה הC-טרמינלי.
תהליך שכפול הDNA קורה ב-3 שלבים עיקריים:
מערכות הדם, המין (אצל הזכר) והעור משכפלות תאים. התא צריך לדעת לסנכרן בין שכפול התא לבין שכפול הDNA.
מחקר שנערך על חיידק ה E-Coli בוצע על מנת להבין כיצד מתבצע התהליך.
בהנחה שהשכפול מתבצע בכל גדיל בו-זמנית, הכיוונים הפוכים.
לקחו DNA מעגלי (הנמצא בחיידקים, וירוסים ובקטריופאג'ים) בזמן ההכפלה ובדקו את זמן ההתחלה והסיום של התהליך. לקראת סיום ההכפלה, הוסיפו למצע החיידקים נוקליאוטידים המסומנים בטרידיום (איזוטופ של מימן, H). אם ההוספה הייתה לקראת סיום ההכפלה ומעט לפני הכפלה חדשה, היה מתקבל אזור יחיד מסומן בDNA. אם ההכפלה היית ל-2 כיוונים היינו מקבלים 2 סימונים רדיואקטיביים.
ניסוי דומה נעשה על חיידק עם פלסמיד (DNA חוץ מעגלי, שאינו חלק מהגנום הכרומוזומלי של החיידק).
פלסמיד יכול לעבור אינטגרציה לתוך DNA הכרומוזומלי של האורגניזם, וכך להיות מוכפל ביחד עם הDNA המקורי, ואף להשתלב לצמיתות בDNA המקורי. פלסמיד שעבר אינטגרציה כזו נקרא אפיזום.
לפלסמיד יש Origin of Replication משל עצמו. קיים מנגנון שבו הOOR של האפיזום מושתק, והOOR של החיידק הוא זה שממנו מתחילה ההכפלה.
הOOR הוא תלוי רצף. ישנם רצפים מסויימים שאם נכניס אותם לתוך הDNA הם יתחילו מאותו OOR. רצף זה צריך להיות מוכר ע"י חלבונים ספציפיים.
בהרבה יצורים הצליחו לאפיין את הרצף ע"י הוצאת מקטע מתוך הרצף, וכתצאה מכך הOOR השתנה.
רצף הOOR מוכר ע"י חלבונים - הם נקשרים אליו ומגייסים את שאר החלבונים לתהליך השכפול.
בזמן החלוקה, הDNA כבר נמצא באמצע תהליך ההכפלה של המחזור הבא.
כאשר שני הגדילים פתוחים, מתחיל תהליך השכפול מכיוון 5' לכיוון 3' בגדיל המוביל (Leading Strand). בגדיל המשלים (Lagging Strand) יש שימוש במקטעי אוקזקי - הגדיל מייצר מקטע קצר בכל פעם.
האנזים DNA-פולימראז מאריך שרשרת קיימת של DNA. לשם כך, יש צורך באנזים נוסף, פרימאז (Primase), שמייצר פריימר מסוג RNA.
ב Lagging Strand נעשה שימוש בהרבה פריימרים, בכל פעם באזור ה5' של מקטעי האוקזקי. לכן, האנזים שפותח את הסליל, הליקאז (Helicase) צמוד לפרימאז.
פרימוזום (Primosome) הוא קומפלקס של פרימאז והליקאז.
על כל גדיל של DNA יש DNA-פולימראז. שני האנזימים האלו (אחד על כל גדיל) מחוברים גם הם בקומפלקס אחד, ולמרות שכל אחד מהם משכפל לכיוון נגדי, הם נעים לאותו כיוון של מזלג ההכפלה כדי שיוכלו לשכפל את שני הגדילים בקצב אחיד.
SSDBP - Single-Stranded DNA Binding Proteins
אחרי שאנזימי ההליקאז פתחו את הDNA, יש שני גדילים "עצמאיים". כדי למנוע את הצמדות הגדילים מחדש, צריך לייצב את המבנה החד-גדילי, ולאפשר קשרי מימן בין הנוקליאוטידים החדשים.
השכפול תמיד מתבצע מכיוון 5' ל3'. נוקליאוטיד חדש תמיד מגיע כ- טרינוקליאוטיד המתווסף לקצה 3'.
ה α-פוספט הוא הפוספט שקשור לקצה 5 של הסוכר.
בקצה ה3' יש קבוצת OH פנויה. אם אין כזו קבוצה פנויה, אי אפשר להאריך את השרשרת, כי כאשר נוקליאוטיד חדש מגיע עם GTP, הG מזהה את הC בעזרת SSDBP, ולאחר הזיהוי יש התקפה נוקליאופילית על הפוספט, והוא מוותר על האלקטרונים של הקשר, ויוצר קשר בין שני הנוקליאוטידים ע"י שחרור הדיפוספט, כך שקיבלנו תוספת נוקליאוטיד לשרשרת עם קבוצת OH פנויה נוספת.
לגבי ה Lagging Strand: הבעיה היא שצריך לסלק פריימרים של RNA. לאחר מכן, צריך להשלים את הפער עם דיאוקסינוקליאוטידים ולסגור את המולקולה.
שלושת האנזימים העיקריים בתהליך הם:
DNA-פולימראז-1: מקודד ע"י הגן פול-A
DNA-פולימראז-2: מקודד ע"י הגן פול-P
DNA-פולימראז-3: מקודד ע"י הגן פול-C
Processivity - מושג שמייצג את מספר הנוקליאוטידים שהאנזים יכול להוסיף למולקולה לפני שהוא נופל ממנו (או לפני שהוא מאבד את יכולת הפעולה שלו).
DNA-פולימראז-3 הוא האנזים בעל קצב העבודה הגבוהה ביותר מבין השלושה, ואצל חיידקים הוא מבצע את כל עבודת השכפול.
DNA-פולימראז-1 ממלא את הרווחים (Gaps) במקום הפריימרים של הRNA.
יש לו 3 פעולות שונות:
מולקולות אלו יוצאות מגרעין התא לציטופלסמה. במהלך השעתוק נוצרות מולקולות RNA, כאשר כיווניות יצירת הRNA היא תמיד מכיוון קצה 5' לכיוון 3' - הנוקליאוטיד החדש תמיד יתווסף בקצה של 3'.
הRNA-פולימראז פותח את הסליל הכפול, וריבונוקליאוטידים מתווספים עד שמולקולות הmRNA והtRNA יורדות. בסוף, מולקולת הmRNA יוצאת לציטופלסמה ומתורגמת לחלבון.
הריבוזום סורק את מולקולת ה mRNA עד שמגיע לקודון ההתחלה "AUG". אז מגיע tRNA עם חומצה אמינית אחרת מתאימה לבניית החלבון. החלבון תמיד נוצר מהקצה הN-טרמינלי לכיוון הקצה הC-טרמינלי.
תהליך שכפול הDNA קורה ב-3 שלבים עיקריים:
- התחלה (Initiation)
- שכפול (Chain elongation)
- סיום (Termination)
מערכות הדם, המין (אצל הזכר) והעור משכפלות תאים. התא צריך לדעת לסנכרן בין שכפול התא לבין שכפול הDNA.
מחקר שנערך על חיידק ה E-Coli בוצע על מנת להבין כיצד מתבצע התהליך.
- קצב השכפול הוא 850 נוקליאוטידים לשניה. אצל יונקים הקצב הוא 60-90 נוקליאוטידים לשניה.
- בDNA של חיידקים (DNA מעגלי) השכפול מתחיל מנקודה אחת. אצל בני אדם (DNA לינארי) יש עשרות עד מאות Origin of Replication, והשכפול מתבצע בו-זמנית מכמה נקודות.
- מחזור חלוקה של חיידק הוא כ-20 דקות, ומחזור שכפול DNA הוא כ-40 דקות.
בהנחה שהשכפול מתבצע בכל גדיל בו-זמנית, הכיוונים הפוכים.
לקחו DNA מעגלי (הנמצא בחיידקים, וירוסים ובקטריופאג'ים) בזמן ההכפלה ובדקו את זמן ההתחלה והסיום של התהליך. לקראת סיום ההכפלה, הוסיפו למצע החיידקים נוקליאוטידים המסומנים בטרידיום (איזוטופ של מימן, H). אם ההוספה הייתה לקראת סיום ההכפלה ומעט לפני הכפלה חדשה, היה מתקבל אזור יחיד מסומן בDNA. אם ההכפלה היית ל-2 כיוונים היינו מקבלים 2 סימונים רדיואקטיביים.
ניסוי דומה נעשה על חיידק עם פלסמיד (DNA חוץ מעגלי, שאינו חלק מהגנום הכרומוזומלי של החיידק).
פלסמיד יכול לעבור אינטגרציה לתוך DNA הכרומוזומלי של האורגניזם, וכך להיות מוכפל ביחד עם הDNA המקורי, ואף להשתלב לצמיתות בDNA המקורי. פלסמיד שעבר אינטגרציה כזו נקרא אפיזום.
לפלסמיד יש Origin of Replication משל עצמו. קיים מנגנון שבו הOOR של האפיזום מושתק, והOOR של החיידק הוא זה שממנו מתחילה ההכפלה.
הOOR הוא תלוי רצף. ישנם רצפים מסויימים שאם נכניס אותם לתוך הDNA הם יתחילו מאותו OOR. רצף זה צריך להיות מוכר ע"י חלבונים ספציפיים.
בהרבה יצורים הצליחו לאפיין את הרצף ע"י הוצאת מקטע מתוך הרצף, וכתצאה מכך הOOR השתנה.
רצף הOOR מוכר ע"י חלבונים - הם נקשרים אליו ומגייסים את שאר החלבונים לתהליך השכפול.
בזמן החלוקה, הDNA כבר נמצא באמצע תהליך ההכפלה של המחזור הבא.
כאשר שני הגדילים פתוחים, מתחיל תהליך השכפול מכיוון 5' לכיוון 3' בגדיל המוביל (Leading Strand). בגדיל המשלים (Lagging Strand) יש שימוש במקטעי אוקזקי - הגדיל מייצר מקטע קצר בכל פעם.
האנזים DNA-פולימראז מאריך שרשרת קיימת של DNA. לשם כך, יש צורך באנזים נוסף, פרימאז (Primase), שמייצר פריימר מסוג RNA.
ב Lagging Strand נעשה שימוש בהרבה פריימרים, בכל פעם באזור ה5' של מקטעי האוקזקי. לכן, האנזים שפותח את הסליל, הליקאז (Helicase) צמוד לפרימאז.
פרימוזום (Primosome) הוא קומפלקס של פרימאז והליקאז.
על כל גדיל של DNA יש DNA-פולימראז. שני האנזימים האלו (אחד על כל גדיל) מחוברים גם הם בקומפלקס אחד, ולמרות שכל אחד מהם משכפל לכיוון נגדי, הם נעים לאותו כיוון של מזלג ההכפלה כדי שיוכלו לשכפל את שני הגדילים בקצב אחיד.
SSDBP - Single-Stranded DNA Binding Proteins
אחרי שאנזימי ההליקאז פתחו את הDNA, יש שני גדילים "עצמאיים". כדי למנוע את הצמדות הגדילים מחדש, צריך לייצב את המבנה החד-גדילי, ולאפשר קשרי מימן בין הנוקליאוטידים החדשים.
השכפול תמיד מתבצע מכיוון 5' ל3'. נוקליאוטיד חדש תמיד מגיע כ- טרינוקליאוטיד המתווסף לקצה 3'.
ה α-פוספט הוא הפוספט שקשור לקצה 5 של הסוכר.
בקצה ה3' יש קבוצת OH פנויה. אם אין כזו קבוצה פנויה, אי אפשר להאריך את השרשרת, כי כאשר נוקליאוטיד חדש מגיע עם GTP, הG מזהה את הC בעזרת SSDBP, ולאחר הזיהוי יש התקפה נוקליאופילית על הפוספט, והוא מוותר על האלקטרונים של הקשר, ויוצר קשר בין שני הנוקליאוטידים ע"י שחרור הדיפוספט, כך שקיבלנו תוספת נוקליאוטיד לשרשרת עם קבוצת OH פנויה נוספת.
לגבי ה Lagging Strand: הבעיה היא שצריך לסלק פריימרים של RNA. לאחר מכן, צריך להשלים את הפער עם דיאוקסינוקליאוטידים ולסגור את המולקולה.
שלושת האנזימים העיקריים בתהליך הם:
DNA-פולימראז-1: מקודד ע"י הגן פול-A
DNA-פולימראז-2: מקודד ע"י הגן פול-P
DNA-פולימראז-3: מקודד ע"י הגן פול-C
Processivity - מושג שמייצג את מספר הנוקליאוטידים שהאנזים יכול להוסיף למולקולה לפני שהוא נופל ממנו (או לפני שהוא מאבד את יכולת הפעולה שלו).
DNA-פולימראז-3 הוא האנזים בעל קצב העבודה הגבוהה ביותר מבין השלושה, ואצל חיידקים הוא מבצע את כל עבודת השכפול.
DNA-פולימראז-1 ממלא את הרווחים (Gaps) במקום הפריימרים של הRNA.
יש לו 3 פעולות שונות:
- פעילות של DNA-פולימראז - הלבשת קצה על שרשרת DNA.
- פעילות של 3'-אקסונוקליאז - בדיקה שהוכנס הנוקליאוטיד המתאים. אם הוכנס נוקליאוטיד שגוי, האנזים יחתוך אותו ויכניס נוקליאוטיד נכון במקומו. זהו מנגנון נגד מוטציות.
- פעילות 5'-אקסונוקליאז - פעילות של חיתוך מולקולות מקצה ה5' של המולקולה.
OOR* = Origin of Replication
אין תגובות:
הוסף רשומת תגובה