ביוכימיה – הרצאה (11.3.08)

שיעור #14

הערה: המבחן לשתי הקבוצות (ביוטכנולוגיה וביולוגיה) יהיה משותף!

נושא ההרצאה: המשך המבנה הראשונ, השניוני והשלישוני.

כיצד ניתן לחזות איך החלבון שמקודד לDNA נראה?
את המבנה השלישוני קשה לקבוע.
משתמשים באלגוריתמים כדי לקבוע את המבנים. למבנה שניוני יש סקלות שעוזרות לנבא מה הם הסיכויים שח. אמינו אחת תהיה מבנה א' ולא מבנה ב'. אם אף אחת משלושת האפשרויות (אלפא-הליקס, משטח-בטא, או TURN) לא מתקיימת...
אנו קובעים ציון כלשהו לכל מבנה (למשל גליצין וואלין) ומשתמשים בטבלה להצגת הציונים של כל מבנה באזור ספציפי של החלבון.
אם הציון של אלפא-הליקס גבוה יותר, למשל, אז אנו מניחים שזה יהיה המבנה עבור האזור הספציפי שאליו התיחסנו. זה נקרא ניבוי, או Prediction.

עבור BPTI, הצליחו לנבא את המבנה השניוני בעזרת אלגוריתמים. אם משווים את הניבוי למבנה האמיתי, רואים שהם דומים מאוד.
כדי לנבא את המבנה השלישוני, משתמשים במבנים דומים (ברצף) שכבר נפתרו.
יש הרבה קבוצות שבונות תוכנות מחשב שמנסות לפענח מבנים של חלבונים לפי מודלים שכבר נפתרו והאלגוריתם שלהם נשמר בסוד.

סיכום פרק 6
ידוע שיש כמה רמות מבנה. הרמה הראשונית היא רצף ח. האמינו.
רצף המבנה השניוני הוא אלפא-הליקס או משטחי-בטא. המבנה השלישוני הוא התארגנות השרשרת הפוליפפטידית במרחב.
המבנה הרבעוני הוא התארגנות של תתי יחידות (בפרק הבא).
מבחינת מבנה שניוני, יש מס' קטן של מבנים מותרים מבחינה סטרית, והם מיוצבים על ידי קשרי מימן.
לחלבונים גלובולריים יש פנים הידרופובי וחוץ הידרופילי.
התרמודינמיקה של הקיפול שלהם תלוי בדינמיקה והאנטרופיה של המערכתץ חלבונים קטנים נוטים להתקפל לבד וחלבונים גדולים צריכים עזרה מצ'אפרונים – חלבונים שעוזרים לחלבונים אחרים להתקפל בתא ומונעים דנטורציה ואגרגציה שלהם.
דנטורציה של חלבונים יכולה להגרם על ידי עליה בטמפרטורה או שינוי בPH.
הסיכוי לניבוי של מבנה שלישוני של חלבון גדול יותר אם מתבססים על מבנה ידוע של חלבון קיים, אך הוא עדיין לא ודאי (נכון להיום).

גלובינים
אורניזמים רבים בטבע זקוקים לחמצן במטבוליזם שלהם. יש אורגניזמים פשוטים שלא צריכים העברה אקטיבית של חמצן (חרקים, למשל). אורגניזמים גדולים ומורכבים יותר צריכים להעביר חמצן לכל חלקי גופם בהעברה אקטיבית.
תפקיד החלבונים ממשפחת הגלובינים (מיוגלובין והמוגלובין) הוא לקשור חמצן.
המיוגלובין (נמצא ברקמות) אוגר חמצן לעת צרה.
ההמוגלובין מעביר החמצן מהריאות לרקמות.

המבנה
המבנה של המיוגלובין ושל ההמוגלובין דומים. הם בנויים מ8 אלפא-הליקס (כל אחד). הסלילים שלהם נקראים A, B, C... H.
70% מהשרשרת הפוליפפטידית היא במבני אלפא-הליקס. אין מבנה הרבעוני של מיוגלובין. לעומת זאת, המבנה הרבעוני של ההמוגלובין הוא של 4 תת יחידות, ש2 מהן הן תת יחידות שלפא, ו2 הן תתי יחידות בטא.
התתי יחידות דומות בינהן, וגם דומות למבנה המיוגלובין.
ההמוגלובין גודלו כ150 ח. אמינו לכל תת-יחידה (כ600 ח. אמינו סה"כ) כאשר כל תת יחידה יכולה לקשור רק מולקולת חמצן אחת (O2).
קבוצת הHEME (קבוצה פרוסטטית) היא קבוצה כימית שאינה מהווה חלק מהחלבון אך נמצאת בחלבון. הקבוצה הזו בנויה
יש משפחה גדולה של תרכובות שנקראות פורפירינים. אחד החלבונים במשפחה זו נקרא פורפין. כאשר מבצעים שינויים בטבעת כלשהי, החלבון הופך לפרוטופורפרין-9. אם מורידים 2H ומוסיפים ברזל, מקבל פרופרוטופורפרין (או קבוצת ההם = HEME). המבנה הזה הוא בעל צבע, וכאשר הוא מתחבר לברזל צבעו אדום. עם מגנזיום צבעו יהיה ירוק (בכלורופיל). עם נחושת הוא יהיה כחול.
הברזל יכול ליצור 6 קשרים: 4 נוצרים עם הטבעת הפרוטופורפירינית, קשר נוסף נוצר עם ההיסטידין שנמצא בהליקס F8 או היסטידין 93. החמצן לא קשור בצורה קוולנטית בגלל הקונפיגורציה. הוא מיוצב על ידי טבעת הN והברזל.
היסטדין נוסף מייצב את החמצן בצד השני והוא נקרא E7 או היסטדין 64.
להיסטדין הקרוב יותר (היסטדין 93) לטבעת הN קוראים PROXIMAL.
להיסטדין הרחוק יותר קוראים DISTAL.

כאשר החמצן צריך להשתחרר הוא עובר ממקום למקום בתוך הסביבה של טבעת הn וההליקסים – זהו תהליך דינמי שבו החמצן עובר ממקום למקום (ב"קפיצות") עד שהוא יוצא.

תהליך הקשירה של החמצן למיוגלובין (MB)
Mb + O2 --> MbO2

מגדירים את הערך [טטא]: שיעור תפוסת המיוגלובין על ידי החמצן.
טטא הוא מספר האתרים התפוסים (SITES OCCUPIED) חלקי סה"כ האתרים האפשריים (TOTAL AVAILABLE SITES).

[להעתיק משוואות מהמצגת]

חוק הנרי: הריכוז של גז מסויים שמומס בתוך נוזל הוא פרופורציונאלי לריכוז אותו גז שנמצא מעל הנוזל.
לכן, אפשר להגדיר את טטא כלחץ החמצן חלקיי לחץ חלקי של חמצן שגורם ל50% מהמיוגלובין להיות תפוס + לחץ חלקי של המערכת.

תהליך הקשירה צריך להיות יעיל (בגלל שיש צורך לאגור את החמצן).
כפי שניתן לראות בגרף, כבר בריכוזים נמוכים של החמצן המיוגלובין תופס אותו חזק (תפוסה גבוהה).

[להעתיק גרף מהמצגת]


להמוגלובין יש 4 תתי-יחידות.
אם מסתכלים על גרף של קשירה חזקה שלו לחמצן, נוכל לשחרר רק חלק קטן ממנו (כ10% מכלל שיעור ההמוגלובין התפוס) וזה תהליך לא יעיל.
אם הקשירה תהיה חלשה, ההמוגלובין יוכל לשחרר חמצן בקלות ברקמות אבל בריאות הוא ישחרר רק כ50%-60% ולכן גם אז זה לא יהיה יעיל.
הפתרון הוא קשירה חזקה בריאות וקשירה חלשה ברקמות.
העקומה, שמתעקמת בצורה סיגמואידלית (שצורתה S), מגדירה מושג שנקרא קואופרטיביות – אינטראקציה קואופרטיבית.
בתתי היחידות כל אחת עוזרת לשכנתה להבין מהי הצריכה של קישור החמצן באותו הרגע.
הקואופרטיביות אומרת שתתי היחידות ירצו לקשור חמצן (אם אחת משחררת חמצן, האחרות גם ישאפו לשחרור חמצן).
התנהגות קואופרטיבית היא חלק מאפקט רחב יותר בביוכימיה שנקרא האפקט האלוסטרי (שאומר שקישור של ליגנד לחלבון משפיע על האפיניות של שאר תתי היחידות או אתרי הקישור במולקולה).

עקומת היל – Hill Plot
בקישור ההמוגלובין לחמצן, בציר הX יש LOG של הלחץ החלקי של החמצן.
בציר הY יש טטא חלקיי 1 חלקיי טטא.
הטטא בהמוגלובין נתונה על ידי לחץ חלקי של חמצן בחזקת n חלקיי לחץ ב50% בחזקת n + לחץ חלקי בחזקת n.
ניתן להפוך את המשוואה הזו למשוואה עם LOG.

[משוואות מהמצגת]

הn הוא השיפוע של גרף היל. בהמוגלובין הוא שווה ל1.
במקרה של המוגלובין הn משתנה לאורך לחצים שונים של חמצן. משמעות שינוי השיפוע היא הזיקה לחמצן.
קישור החמצן הראשון מתנהג כשיפוע של 1. השיפוע משתנה ויכול לעלות עד כ3.5 .
במצב הזה, קישור לחמצן השני והשלישי מתבצע בזיקה חזקה יותר מאשר הקישור של החמצן הראשון.
למולקולה של 3 חמצנים יש אתר קישור אחד שנותר, ובמצב כזה השיפוע גם יהיה 1.
למצב שבו השיפוע הכי חזק, כ3.5, קוראים מצב מעבר.
המצב ההתחלתי שבו השיפוע 1 נקרא מצב קישור חלש.
המצב האחרון שבו השיפוע גם 1 נקרא מצב קישור חזק.

ביוכימיה - הרצאה (9.3.08)

שיעור #13

Glubular Proteins – חלבונים גלובולריים
אלו חלבונים שיוצרים מבנה תלת מימדי שדומה לכדור. הם אוסף של מבנים שניוניים (α-הליקס, ומשטחי- β). המידע על קיפול החלבונים מגיע מדפרקציה של קרני-X, וכך מקבלים את האינפורמציה על קיפולי החלבון. לפעמים הדיפרקציה מגיעה ל0.3 ננומטר – דבר שמאפשר לעקוב אחרי המבנה המרחבי החלבון ומאפשר לראות ממה הוא מורכב.
BPTI – מעכב של טריפסין (מסונתז בלבלב של פרות), הוא אנזים שעושה פרוטוליזה לחלבונים אחרים.
פרוטיאזות = אנזימים שחותכים חלבון אחר. לפעמים רוצים להפסיק פעילות כזו ואז קושרים חלבון BPTI שעוצר את הטריפסין (הופך אותו לבלתי פעיל).
BPTI מורכב מ154 חומצות אמינו. בתצוגת מודל-שלד (Skeletal) אפשר להציג את המבנה המרחבי של החלבון. ניתן למדוד את המרחקים בין אטומים של חלבון בעזרת דפרקציה של קרני X.
דרך נוספת להציג את החלבון היא להראות מבנים שניוניים של החלבון היא Ribbon Model – תצוגה שמראה את המבנה השניוני של החלבון. מבנים שניוניים שמחוברים בינם לבין עצמם ללא סידור מוגדר נחשבים כ Random Coil.
צורה שלישית היא Space Filling Model היא צורה שמראה עד כמה החלבון דחוס.
אוסף של כל האטומים של חלבון מסתדרים למבנה דמוי כדור, ומכאן השם "חלבונים גלובולריים".

מיוגלובין (Myoglobin) הוא חלבון שקושר חמצן. אם נסתכל על צורת השלד שלו, נוכל לראות את הברזל. למיוגלובין יש קבוצה פרוסטטית – מולקולה קטנה שנקשרת לחלבון בצורה לא קוולנטית ומקנה לו פונקציה כלשהי. הקבוצה הפרוסטטית נקראת "הם".
כ70% מהמיוגלובין מורכב מ α-הליקס שקשורים בינהם ללא צורה ספציפית. זה נכון לגבי כל חלבון גלובולרי – המבנה התלת מימדי של כל חלבון ייחודי לו.

כל החלבונים מורכבים מאותם מבנים שניוניים שחוזרים על עצמם. אפשר לראות מכנה משותף: לחלבונים כבדים יש Domain שמכיל אזור מקופל. החלבון הגדול הוא אוסף של מבנים שמקופלים ומחוברים בינהם במבנים אקראיים. חלבון BPTI מכיל Domain אחד בלבד כי הוא יחסית קטן.
יש חלבונים שמכילי Domain שקושר ATP או סובסטרט כלשהו. ה Domain בנויים על 2 עקרונות:
1. על בסיס α-הליקס – קיפולים על גבי קיפולים.
2. על בסיס משטחי- β

עד היום נאסף הרבה מאוד מידע לגבי חלבונים שונים ורבים. מצאו ש:
לכל החלבונים הגלובולריים יש אזורים פנים וחוץ מוגדרים. מחוץ לחלבון יש חומצות אמינו הידרופיליות, ובפנים הידרופוביות. אנו יוצרים סביבה הידרופובית בתוך החלבון.
האזור החיצוני מייצב את החלבון על ידי קשרי מימן.
המבנים של β-sheets בד"כ גורמים לצורה מרחבית של חבית - Barrel (צורה יציבה יותר לחלבון).

שרשרת פוליפפטידית יכולה לשנות כיוון. אם עוקבים אחריה, אפשר לראות שהיא יכולה להתקפל על עצמה ולפנות לכיוון אחר (אפילו 180 מעלות או יותר). סיבוב כזה נקרא Turn, וקיימים מספר סיבובים:
1) סיבוב בטא – β-TURN. בסיבוב זה יש 4 חומצות אמינו שיוצרות את הסיבוב. הסיבוב נוצר על ידי קשרי מימן של חמצן קרבונילי של ח. אמינית מס' 1 לבין אמיד של ח. אמינו מספר 4.
2) סיבובים דחוסים יותר, GAMA-TURN, קשר מימן נוצר בין חמצן קרבונילי על חומצה אמינית מספרן 1 לבין אמיד של ח. אמינית מס' 3.
לא כל מבנה של חלבון ניתן לשייך לקבוצה – קיימים מבנים אקראיים ולא מוגדרים.
כל הגורמים הנ"ל מגדירים חלבון גלובולרי.
הרצף של חומצות האמינו בחלבון קובעת את המבנה המרחבי של החלבון.
להלן מספר נתונים\הוכחות שמראים כי רצף חומצות האמינו אכן קובע את המבנה התלת-מימדי של החלבון:

הוכחה ראשונה:
שינוי ח. אמינו אחת בחלבון יכולה לשנות לחלוטין את המבנה המרחבי של החלבון.
באריטרוציט קיים חלבון ההמוגלובין. כאשר בהמוגלובין יש מוטציה כלשהי היא הופכת אותו לצורה חרמשית הדומה לאות C במקום צורה של O. הפנוטיפ של מוטציה זו גורם למחלת האנמיה.
האינפורמציה לגבי המבנה השלישוני של החלבון קשורה לרצף ח. האמינו שלו.

הוכחה שניה:
של Anfinsen. בשנות ה50 עשה את הניסויים שהביאו אותו לתגליות הבאות:
הוא עבד על חלבון ריבונוקליאז-A שמפרק מולקולות RNA. הוא לקח את החלבון הזה בצורתו המקופלת\נאטיבית (התלת מימדית). בחלבון הזה יש קשרי S-S דיסולפידים, שנובעים מקישור של ציסטאינים. הוא ראה שיש לו חלבון מקופל עם קשרי S-S ועשה לו דנטורציה (דנטורציה נגרמת ע"י שינוי בPH או חימום. גם אוריאה [שתנן] גורם לדנטורציה). אם בחלבון יש קשרי S-S (קשרים קוולנטים חזקים) ורוצים לפרק אותם, חייבים לחזר את החלבון על ידי בטא-מרקפטו-אתאנול.
הוא לקח RNA והוסיף לו חומר זה, וקיבל שרשרת פוליפפטידית פתוחה ולא מקופלת. אחרי זה הוא העביר את החלבון לתמיסה שלא מכילה את החומרים שגורמים לדנטורציה, וראה שהחלבון שוב מתקפל לאותו מבנה שלישוני שהיה מצוי בו בהתחלה.
ככל שמעלים טמפרטורה, החלבון עובר יותר Unfolding ; המבנה השלישוני של החלבון מוכתב ע"י המבנה הראשוני שלו.


התרמודינמיקה של הקיפול
אם רוצים ששרשרת פוליפפטידית תהפוך למקופלת, השינוי באנרגיה החופשית צריך להיות שלילי (ΔG).
השינוי באנטלפיה (ΔH) הוא החום שנקלט או נפלט מהמערכת. אם הוא שלילי, גם ΔG שלילי. בקיפול חלבונים, יוצרים הרבה קשרים מועדפים אנרגטית שיוצרים את המבנה המרחבי של החלבון. קשר מטען-מטען (או גשר מלח) הוא בין שייר ח. אמינו שלילי לבין שייר טעון חיובית (למשל בין ליזין לגלוטומאט). קשר זה גורם למשיכה אלקטרוסטטית ותלוי בPH בו החלבון מצוי. בPH נייטרלי שתי הקבוצות טעונות. בPH חומצי מאוד או בסיסי מאוד, אחד השיירים לא יהיה טעון, ונאבד את האינטראקציה ונקבל דנטורציה של החלבון. קשרים אלו מייצבים את המבנה השלישוני של החלבון.

גם קשרי מימן גם מייצבים את המבנה השלישוני של החלבון.
קשרי ונדרולס גם מייצבים את החלבון, למרות שהם חלשים.
מה שגורם לייצוב מבנה החלבון בסופו של דבר הוא כמות הקשרים. הרבה קשרים מייצבים את החלבון בצורה טובה יותר.
כל שלושת הקשרים הללו אינם קוולנטים. קשרים קוולנטים הם חזקים מאוד, ולכן קשה מאוד לשבור אותם.

אנתרופיה – רמת האי-סדר של המערכת.
כדי ש ΔG יהיה שלילי יותר, כך האנטרופיה צריכה להיות יותר חיובית.
אם האנטרופיה ירדה, ה ΔG יהיה חיובי יותר. זה אנטרופיה של קונפורמציה שפועלת נגד ה"רצון" של החלבון להתקפל.

כאשר שרשרת פוליפפטידית פתוחה, הקשרים ההידרופוביים פונים למים, והמים יוצרים סביבם מבנים מסודרים של גביש. כאשר החלבון מתקפל כל הח. אמינו ההידרופוביות שלו נכנסות לחלבון. האנטרופיה של המערכת גדלה. ΔS חיובי, וגורם ל ΔG להיות שלילי.
אנטרופיה של קונפורמציה פועלת נגד רצון החלבון להתקפל. הגורם השני – האפקט ההידרופובי – פועל לטובת קיפול החלבון. אם נסתכל על כל הכוחות הפועלים ביחד, ΔG יהיה שלילי ונקבל העדפה אנרגטית.

יש חשיבות רבה לח. אמינו הידרופוביות בחלבון. לפי טבלה אפשר לקבוע את ההידרופוביות היחסית של כל ח. אמינו. כל סקלה יכולה להגיד איזו ח. אמינו היא הידרופובית ואיזו הידרופילית. חובה לעבוד עם סקלה אחת כל הזמן.

מה נוצר קודם – קיפול החלבון או קשרי הS-S?
אם נרצה ליצור בין 8 ציסטאינים - קשרי S-S, נוכל לקבל 105 אפשרויות: אם יש 8 ציסטאיניים, לראשון יש 7 אפשרויות קשירה לכל אחד מהאחרים. לבא אחריו יש 5 אפשרויות. סה"כ יש 3x5x7 = 105 אפשרויות!
קודם החלבון מתקפל לצורה תלת מימדית ורק אח"כ נוצרים קשרי S-S שמחזקים את המולקולה. לBPTI יש 3 קשרי S-S.
בסביבה מחוזרת אין קשרי S-S, ורק לחלבונים שמופרשים מתוך התא יש קשרי S-S שמייצבים את המבנה שלו.

סיכום ביניים:
סביבה ציטוזולית לא מאפשרת יצירת קשרי S-S. חלבונים מחוץ לתא, עובדים בסביבה מחמצנת, והציסטאינים שלהם כן יכולים ליצור קשרי S-S שמייצבים את המבנה המרחבי של החלבון.

בתוך התא, לא כל החלבונים מסוגלים להתקפל לבד וזקוקים לעזרה.
משפחה של חלבונים, צ'אפרונים, תפקידה לעזור לחלבונים להתקפל. (צ'אפרון = מלווה).
יש הרבה משפחות של צ'אפרונים:
1) מקורה בחיידק: GroEL, GroES. שני חלבונים אלו שייכים לאותה משפחה. GroEL מורכב מ2 טבעות. כל טבעת מורכבת מ7 תת-יחידות ובתוך כל טבעת יש חלל. החלבון הלא מקופל נכנס לחלל הזה, וכדי להשאר שם, חלבון GroES מכסה אותו, ומקבלים מבנה שדומה למבחנה עם מכסה (שהחלבון לכוד בפנים). הGroES מבודד את החלבון מהסביבה ונותן לו סביבה הידרופובית, והחלבון הלא מקופל ממתין. כאשר החלבון מתקפל, המכסה עוזב ומשחרר את החלבון. על ידי יצירת סביבה הידרופובית יוצרים מצב קל לחלבון להתקפל.
2) משפחה של DnaK – חלבון מחיידק ששייך למשפחה של חלבוני HSP – Heat Shock Proteins. תפקידו של DnaK הוא להקשר לשרשרת פוליפפטידית לא מקופלת ולאפשר לה להתקפל לבד. אחרי התרגום יש שרשרת פוליפפטידית שעדיין לא הספיקה להתקפל. היא יכולה לפגוש שרשרת אחרת, ונקבל קשרים הידרופוביים בין שתי שרשראות ונקבל חלבון שלא יכול להתקפל. מצב כזה נקרא אגרגציה. חלבון שיוצר אגרגאט הוא חלבון לא פעיל. DNAK מונע מהשרשרת הפוליפפטידית להקשר לשרשראות אחרות. אחרי מכת חום, כאשר שרשרת פוליפפטידית לא מקופלת נקשרת לDnaJ, הוא מגייס את הDnaK. DnaK יכול להקשר לשרשרת פוליפפטידית לא מקופלת. לDnaK יש 2 Domains – אחד אחראי לקישור ATP והשני אחראי לקישור של סובסטראט.
כאשר DnaK קשור לATP האפיניות שלו לקשירת שרשרת פוליפפטידית נמוכה מאוד. כאשר ADP קשור לDnaK, הוא נקשר לשרשרת חזק.
כשרוצים לשחרר את השרשרת, הופכים ADP בחזרה לATP על ידי חלבון שלישי שנקרא GrpE שמחליף את הADP בATP. עכשיו לDnaK יש אפיניות נמוכה, והוא משתחרר מהשרשרת הפוליפפטידית.

פריאונים – PRIONS
מחלת הפרה המשוגעת נגרמת ע"י פריאונים.
ב1996, סטנלי פרוזינר, גילה שהפרה המשוגעת עוברת על ידי חלבונים. הפריאון, הוא חלבון שנקרא PRPC – Prion Related Protein Cellular.
מסיבה לא ידועה, החלבון יכול לשנות את צורתו ל PRP Scrapie (מחלה שדומה לפרה המשוגעת אך קיימת בכבשים) שהוא חלבון מסוכן שיוצר סיבים בתא ומחורר את מערכת העצבים של בעל חיים.
PRPC נמצא בגוף, אך לא ידועים בדיוק את תפקידו. מה שכן יודעים, זה שPRP SCRAPPIE הוא הצורה הרעה של החלבון, והוא מדבק וגורם למוות של חיות (או בני אדם).