יום שני, 7 באפריל 2008

ביוכימיה – הרצאה (30.3.08)

שיעור #18

Kcat – The turnover number

חלק 1: משמעות הקינטיקה האנזימטית

חלק 2: סוגים שונים של מעכבים

Kcat הוא מדד לפעילות הקטליטית של האנזים, והוא גם מודד את הסיבובים (או מס' המחזורים של האנזים). במילים אחרות, זהו מס' מולקולות הסובסטרט שנהפכות על ידי האנזים לתוצר ליחידת זמן.

ככל שהKcat גבוה יותר, האנזים פעיל יותר, והוא נמדד כ Sec/-1.

Kcat יכול להיות 1, 0.5 או אפילו מיליונים לשניה.

הK2 מוגדר כשלב המגביל. לכל שלב שנוסף יש K משלו, ולרוב יש כנראה לפחות שלב אחת שמגביל את התגובה (צוואר בקבוק).

הKcat הוא מדד לכל השלבים שאם לא עוברים אותם (והם מעכבים את התפתחות התגובה) התגובה לא תתרחש, או שהיא תתרחש באיטיות רבה.

כשבודקים קינטיקה צריך רק לבדוק את ערכו של Kcat.

Kcat במקרה של מיכאליס-מנטן הוא K2.

1. Kcat הוא מדד לכושר הקטליטי של האנזים.

2. מס' המולקולות במולים של הסובסטרט שעוברות שינוי למול של אנזים לשניה.

3. - מס' המחזוריםturnover-number. המס' יכול לנוע מ40 מיליון פעולות לשניה (עבור קטלאז) ועד ל0.5 פעולות לשניה (עבור ליזוזום).

אפשר להשתמש ביחס בין Kcat לkm כדי להגדיר את יעילות האנזים.

אם הkcat נמוך מאוד, יקח הרבה זמן להפוך את הסובסטראט לתוצר. לכן, אפשר להשוות בין אנזימים שונים לפי היחס בין Kcat ל Km שמהווה את היעילות הקטליטית.

לכל אנזים יש Km וkcat מסויים עבור פעילות קטליטית כלשהי. ככל שהיחס גדול יותר, האנזים יעיל יותר ונותן יותר תוצרים עבור אותה יחידת זמן.

גרף של V כפונקציה של ריכוז הסובסטראט עבור שני אנזימים: אם מכפילים את ריכוז האנזים פי 2, גם מהירות הריאקציה תגדל פי 2.

יש אנזימים שצריכים 2 סובסטראטים כדי לפעול. הפעילות שלהם נקראת Random כי הם מסוגלים לקשור סובסטראט א' או ב'. הקשירה מתבצעת בצורה אקראית. יש גם פעילות קישור מסודרת – עד שאנזים לא קושר סובסטראט א', הוא לא יוכל לקשור את סובסטראט ב'.

פעילות פינג-פונג

זוהי פעילות שבה יש כמה מצבים שבהם האנזים יכול להמצא. מצב ברירת המחדל הוא הE. תוך כדי שהאנזים קושר את הסובסטראט, חלק מS1 הופך לP1. P1 משתחרר, אבל שארית מS1 עדיין קשורה לאנזים והוא נמצא במצב ביניים שנקרא E'. הסובסטראט השני נקשר, התגובה האנזימטית מתבצעת וS2 הופך לP2. בסוף התהליך האנזים נשאר E (לא עובר שינוי אבל במצב הביניים, באמצע התגובה, האנזים הופך לE' כי הוא קשר משהו.

כימוטריפסין עובד לפי מנגנון פינג-פונג: האנזים מנתק את הקשר הפפטידי באתר הפעיל, והחלק הN-טרמינלי עדיין קשור לאנזים. כדי לשחרר את החלק הקשור צריך מים. מים הם הסובסטראט השני שמסוגל לשחרר את השרשרת.

מעכבים

חומרים שמעכבים פעילות אנזימטית – מתחלקים ל2 קבוצות.

1) מעכבים הפיכים

2) מעכבים בלתי הפיכים

למעכבים הפיכים יש לרוב קישור לא קוולנטי של הקישור לאנזים. במצב של מעכב בלתי הפיך יש לרוב קישור קוולנטי של המעכב לאנזים.

מעכבים בלתי הפיכים הם הרבה פעמים רעלנים שמשבשים את פעילות האנזים.

מעכבים הפיכים

מסוגלים לעכב את הפעילות האנזימטית, אבל כאשר מסלקים את המעכב, מחזירים את הפעילות האנזימטית לקודמה.

אפשר להפריד מעכב הפיך מאנזים בעזרת דיאליזה – המעכב יעבור דילול והאנזים לא יעבור דיפוזיה (הוא ישאר בשקית). כשהמעכב מסולק מהתמיסה, האנזים ימשיך לפעול כרגיל.

Ki – קבוע העיכוב.

ישנן 2 קבוצות עיקריות של מעכבים (כולם הפיכים), וקבוצה שלישית תיאורטית:

1. מעכב תחרותי

2. מעכב לא תחרותי

3. מעכב בלתי-תחרותי – לרוב מקרה שלא קיים באמת.

מעכב תחרותי נקשר לאתר הפעיל של האנזים כי הוא דומה לסובסטראט. יש לו אפיניות גבוהה לאתר הפעיל ביחס לסובסטראט.

האנזים יכול להקשר או לסובסטראט או למעכב. אם נוצר קומפלקס EI, לא קורה כלום. ככל שמגדילים את ריכוז הסובסטראט, המעכב ישפיע פחות, כי יש יותר סובסטראט מאשר מעכב, ויש יותר סיכוי שאנזים יקשר לסובסטראט.

המעכב מפריע לפעילות הקטליטית (לא נותן לסובסטראט להפוך לתוצר) לכן צריך יותר סובסטראט כדי לקבל את אותה כמות תוצרים (או אותה מהירות), לכן צריך להעלות את הkm.

כאשר משווים בין שני גרפים – אחד עם מעכב והשני בלי מעכב, שניהם יגיעו בסופו של דבר לאותו Vmax, אבל במקרה שיש מעכב נוסיף יותר סובסטראט כדי להגיע לvmax.

מעכב לא-תחרותי

זהו מעכב שלא נקשר לאותו אתר פעיל כמו הסובסטראט (הוא נקשר באתר אחר על גבי האנזים).

מעכב לא תחרותי פוגע בפעילות האנזים (לא פוגע בקישור לסובסטראט).

האפיניות של האנזים לסובסטראט לא משתנה כתוצאה מהקישור של האנזים למעכב, ולכן Km נשאר קבוע. Vmax הוא זה שיורד.

בסופו של דבר המעכב מוריד את יעילות האנזים. הkm לא משתנה.

סוג נוסף של מעכבים הפיכים (לא נדבר על המשוואות שלהם) הוא מעכב מעורב – Mixed Inhibitor. אותו מעכב מסוגל להשפיע על Vmax וגם על Km.

אף אחד מהחיתוכים של הגרפים לא נשאר קבוע.

אפשר להשתמש במעכבים כתרופה – לדוגמא ריטונביר – ritonavir. זו תרופה שמבוססת על פפטיד, שדומה לאזור הפפטידי שהפרוטיאז שוירוס הHIV מזהה, והוא הכרחי לקיפול של הוירוס ולפעילות של הוירוס.

סונתז מעכב שדומה לאתר שמזוהה על ידי הפרוטיאז. בחלק מהזמן, האנזים של הוירוס נקשר למעכב במקום לתאים.

מעכבים בלתי-הפיכים

יש בהתחלה שיווי משקל בין המעכב לאנזים. בשלב כלשהו, המעכב תוקף את האנזים וגורם לאינאקטיבציה של האנזים על ידי קשירה קוולנטית באחד האתרים שלו (לא בהכרח באתר הפעיל). אין אפשרות להחזיר את הפעילות האנזימטית לקדמותה לאחר שהמעכב מסולק.

המעכב יכול להקשר לאנזים גם כאשר קשור לו סובסטראט. שלב זה יכול להיות הפיך, אבל אחרי זמן מסויים המעכב תוקף את האנזים, ונקשר קוולנטית.

לקבוע התגובה קוראים Kinact.

בסוף נקבל קומפלקס אנזים-מעכב הקשורים בקשר קוולנטי שלא ניתן להפריד בינהם. משוואות התהליך מסובכות מאוד.

פנאצילין הוא בלתי הפיך – הוא מעכב אנזימים שמעורבים בסינתזה של דופן החיידק.

ביוכימיה – הרצאה (25.3.08)

שיעור #17

טריוז-פוספט-איזומראז – אנזים שחשוב בגליקוליזה. יש 3 חומרים שנוצרים: גליקופוספט, סיסנדיול והתוצר הסופי: דיהידרוקסי אצטון פוספט.

המבנה הרבעוני שלו הוא 2 תת יחידות זהות. יש ח. אמינו באתר הפעיל: גלוטומאט 165, היסטדין 95 שיש להן תפקיד חשוב בהפיכת G3P ל DHAP.

יש מכסה שמכסה את הסובסטראט, ותפקידו לייצב את מצב הביניים. אם נפגע במכסה הזה, נוריד את יעילות התגובה האנזימטית. המכסה הוא חלק מהחלבון ומייצב את ה C-CENDIOL למרות שהוא לא חלק מהאתר הפעיל.

האנזים פוגש את הG3P וקושר אותו. אחרי זה יש הפיכה ל C-CENDIOL שקשור לאנזים, והוא הופך לDHAP ולבסוף הDHAP משתחרר.

האננדיול נוצר על ידי העברת הפרוטון של הG3P שהופך לOH. הפרוטון "נגנב" על ידי הגלוטומאט.

הקשר הכפול בין C לC נפתח ומתקבל DHAP. האנזים חוזר למצבו ההתחלתי ויכול לקטלז תגובה נוספת – הוא לא עובר שינוי תמידי.

מצבי הביניים הם בעלי אנרגיה חופשית נמוכה. תגובה כזו יכלה להתרחש ללא אנזים, כשנוסיף אנזים למערכת הוא ייצב את מצבי הביניים; האנרגיה החופשית יורדת כל הזמן.

סרין פרוטיאזות

זו משפחה גדולה של חלבונים עם 3 נציגים:

כימוטריפסין ואלסטאז. הם מסונתזים לרוב בבלוטת הלבלב וחשובים לפירוק חלבונים במעיים (מפרקים את הקשר הפפטידי). לכולם יש אספרטאט (חומצה אספרטית), היסטדין וסרין.

בקיפול החלבון, חומצות אמינו שרחוקות במבנה הראשוני יכולות להיות קרובות יותר במבנה השניוני.

בפרוטיאזות האלו יש כיס, POCKET, שנמצא תמיד קרוב לסרין. הכיס הוא אזור מוגן בחלבון והאופי שלו שונה בין סרין-פרוטיאזות שונות. בכימוטריפסין רואים שהכיס הזה הוא מאוד הידרופובי, והוא ירצה למשוך אליו אזור הידרופובי אחר.

בטריפסין יש מטען שלילי בתוך הכיס, והוא ירצה למשוך מטען חיובי, למשל ארגנין, ליזין...

אפשר להגדיר 6 שלבים של התגובה הקטליטית של כימוטריפסין:

1. קישור של השרשרת הפוליפפטידית שיש לפרק.

2. הפרוטון של הOH מקבוצת ההידרוקסיל מסוגל לעבור מסרין להיסטדין, כך שההיסטדין יהיה טעון חיובי. נוצר מצב של חמצן עם קשר אחד פתוח – לכן הוא יתפוס את הפחמן שהוא חלק מהקשר הפפטידי של האתר.

3. הפחמן של הקשר הפפטידי (בין C לN) עוזב את החנקן לטובת הסרין ונוצרו 2 שרשראות פוליפפטידיות במקום אחת שהייתה בהתחלה.

4. ההיסטדין פנוי, והוא תופס מולקולת מים.

5. המים מתפרקים כאשר ההיסטדין גונב פרוטון מהמים, והOH מתקשר בחזרה לחלק הN-טרמינלי של החלבון שקשור לחמצן.

6. הקשר בין הפחמן לחמצן מתנתק, ונשאר לסרין לקחת פרוטון מההיסטדין, והוא חוזר להיות OH.

מבחינה כימית, יש צורך במים כאשר חלבון מתפרק. לכן מים הם גורם חשוב בהידרוליזה של חלבון.

בשני החלבונים יש היסטדין, וגם חומצה אמינית חומצית.

היסטדין היא ח. אמינו חשובה כי הPKA שלה קרוב לPH הפיזיולוגי, ולכן יש הרבה פעמים היסטדין במולקולות בעלות פעילות אנזימטית.

קינטיקה של אנזימים

ניתן לעקוב אחרי פעילות האנזים על ידי הסתכלות על קצב הופעת התוצר או קצב העלמות הסובסטראט.

מהירות הריאקציה יורדת עם הזמן (קצב יצירת התוצר לאחר זמן מסויים הולך ודועך). ריכוז הסובסטראט הולך ויורד עם הזמן.

יש מעכבים שיכולים להיווצר במהלך האקטיבציה שמורידים את קצב התגובה.

הקינטיקה של האנזימים יכולה לעזור לנו להבין איך האנזים מתנהג בהשפעות שונות, למשל כתלות בPH, בריכוז האנזים עצמו, בטמפרטורות שונות וכתלות במעכבים.

מודל מיכאליס-מנטן (יהיה במבחן!)

מיכאליס ומנדל ניסו לבנות מודל שמתאים לקינטיקה של אנזימים, והם הניחו את ההנחות הבאות:

1) בתהליך יש יצירה של קומפלקס אנזים-סובסטראט.

2) מגיעים למצב STEADY-STATE מהר מאוד (שהES קבוע)

3) הקישור של התוצר לאנזים וחזרה לES הוא שלב זניח.

מודל המצב העמיד

K1 וK-1 הם קבוע המהירות לכל כיוון.

K2 הוא קבוע התגובה שבה אנזים+סובסטראט (מצב מגביל) הופך לתוצר ואנזים.

ניתן לכתוב את מהירות התגובה:

V=K2[ES]

[E]t = [ES] + [E] [E]t כמות האנזים הכללית

[E] = [E]t – [ES]

K1[E][S] = ES קצב יצירת

K-1[ES] + K2[ES] = ES קצב פירוק

K1[E][S] = K-1[ES] + K2[ES]

[ES] = [E]t[S]

----------------------

K2+K-1 + [S]

-----------

K1

Km = K2 + K-1

-----------

K1

Vmax --> קצב התגובה המקסימלי

Vmax = K2[E]t

V = Vmax[S]

--------------

Km + [S]

Km - קבוע מיכאליס, מסמל את הריכוז שבו Vmax הוא חצי.

אם S=Km, V=1/2 Vmax.

קבוע מיכאליס מאפיין את התגובה האנזימטית בין אנזים מסויים לסובסטראט נתון.

אפשר להתייחס לkm כמדד לאפיניות של האנזים לסובטראט.

Vmax הוא ערך תיאורטי – אף פעם אי אפשר להגיע אליו.

שני מדענים, הגיעו למשוואה (כמה שנים מאוחר יותר) שמגדירה את Vmax.

משוואת Lineweaver-Burk

1/V = Km/Vmax x 1/[S] + 1/Vmax

ביוכימיה – הרצאה (18.3.08)

שיעור #16

סיכום עד עכשיו:

בריאות הלחץ החלקי קבוע, ומעודד קישור של חמצן להמוגלובין. זה גם מתנגד לאפקטים אלוסטרים אחרים שגורמים להמוגלובין להתחמצן.

כאשר ההמוגלובין במצב OXY נכנס לרקמות החמצן משתחרר, אבל נכוחות של CO2 מעודדת אפקט בור, וגם יצירת קרבמאט שמעודד שחרור חמצן.

הBPG עוזר לשחרור החמצן כי הוא מעודד מצב DEOXY. המוגלובין מסוגל לקשור CO2 בעיקר במצב DEOXY.

הDEOXY-המוגלובין חוזר לריאות ששם הPH גבוה יותר (אפקט בור הפוך) ששם יש CO2 נמוך יותר. הCO2 עובר בדיפוזיה ומשתחרר בריאות.

אנמיה חרמשית נפוצה יותר באיזורים חמים (סאבטרופיקליים). הסיבה לכך היא מלאריה.

מה גורם לאנמיה חרמשית? (Sickle Cell)

במוטציה יש שינוי ברצף הDNA. יש כמה סוגי מוטציות:

Missense Mutation – החלפה של בסיס בDNA על ידי בסיס אחר. באנמיה חרמשית זה המקרה. A הופך לT וחומצה גלוטמינית הופכת לואלין. שינוי אחד גורם למחלה הזו.

Nonesense Mutation – החלפת הבסיס גורמת לSTOP-CODON וקוטעת את רצף החומצות אמינו.

Frameshift – הפרעה למסגרת הקריאה.

Deletion Mutation – מחיקה של בסיס שגורמת להזזת מסגרת הקריאה, מה שגורם ברוב המקרים לשינוי טוטלי של החלבון.

הפיכה של גלוטמין לואלין, גורם לחומצה אמינית הידרופובית שמופיע על פני השטח של החלבון. נוצרת תגובת שרשרת – הידרופובי פוגש הידרופובי, ויש שקיעה של ההמוגלובין בתוך תא הדם האדום. השיקוע הזה משנה את הצורה החרמשית של התא וגורם לליזיס של התא, מה שמוביל לפחות תאי דם פעילים שיכולים לשאת חמצן.

רוב ההמוגלובינים המוטנטים (כ95%) הם החלפה של חומצה אמינית אחת בלבד. יש מוטנטים שלא משנים כלום ויש כאלו שיכולים לגרום למחלות קשות. סוג מסויים של מחלות נקרא "טלסמיה" – מחלה שמתבטאת במחסור של שרשרת אחת של המוגלובין. טלסמיה יכולה להגרם ממחיקת גן או FRAMESHIFT MUTATION.

בטא-טלסמיה היא מחלה קשה (קטלנית), אך פחות קשה אם מדובר במצב הטרוזיגוטי. אם רק גן אחד נמחק, האדם יוכל להסתדר עם ההעתק היחיד של הבטא.

אלפא-אלסמיה היא מחלה פחות קשה מבטא-טלסמיה, כי יש לנו 2 גנים לאלפא (אלפא-1 ואלפא-2): מקבלים 2 מכל הורה, וסה"כ יש 2 אלפא-2 ושני אלפא-1. אם חסרות 3 שרשראות או 4, המצב קשה מאוד...

נוגדנים

נוגדנים הם חלבונים גלובולריים. המשותף להם ולהמוגלובין הוא ששניהם קושרים משהו (נוגדנים קושרים אנטיגנים, והמוגלובין קושר חמצן). אפשר לחלק אותם ל5 משפחות: IGA, IGE, IGD, IGM, IGG.

IGG – IMUNOGLOBIN. המבנה הרבעוני שלהם מורכב מ4 שרשראות – 2 כבדות ו2 קלות. השרשראות קשורות בינהם על ידי קשר דיסולפידי. החלק שנקשר להאנטיגן (החיידק או הוירוס) נקרא FAB. החלק שלא נקשר לחיידק נקרא FC.

שני הFABים יכולים להקשר ל2 אנטיגנים בו זמנית (2 אתרי קישור בנוגדן אחד). הציר בינהם (הHINGE) הוא חלק מהשרשרת הכבדה.

המולקולות האלו נקראות גם Antigenic Determinant. אנטיגן מוגדר כחומר שמסוגל לעורר תגובה של מערכת החיסון. זה יכול להיות גם וירוס, בקטריה או חלבון קטן. נוגדנים יכולים להקשר בצורה מאוד ספציפית לאנטיגנים. לא כל האנטיגן מסוגל להקשר לאנטיגן – יש אזורים מיוחדים שנקראים Antigenic Determinant שאליהם נקשרים נוגדנים באפיניות גבוהה. כשמסתכלים על נוגדן, שתי הזרועות שלו קושרות את אותו אנטיגן. הנוגדן יכול לגרום בצורה כזו לשקיעה וסילוק של האנטיגן (כאשר הם מחוברים ביחד).

כאשר נוצר קומפלקס גדול של נוגדנים שנקשרו לאנטיגנים, מערכת החיסון מבינה שיש בעייה ומסלקת את הקומפלקס.

תאי הB ממשפחת הלימפוציטים הם שמייצרים את הנוגדנים. לחלק מהם (EFFECTOR CELLS, PLASMA CELLS) יש תפקיד של ייצור אנטיגן בלבד – וחלק יכולים לשמש כתאי זיכרון חיסוניים, MEMORY CELLS, למקרה שהגוף יפגוש באנטיגן בעתיד.

יצירת נוגדנים היא תגובה "הומורלית". זהו מונח שמקביל לתגובה תאית (Cellular Response). התגובה התאית מתווכת על ידי סוגים אחרים של תאים, שהמוכרים בינהם הם הלימפוציטים T. אם הנוגדנים מסתובבים בחופשיות בדם וצריכים לקשור אנטיגנים, התגובה התאית היא יותר דינמית וחכמה: היא עושה שימוש בתקשורת בין תאים.

דוגמא: סרטן מתפתח בגוף שלנו (לא ממקור חיצוני) ותא סרטני יכול לפלוש להרבה מקומות בגוף ולא תמיד נראה הבדל כי הוא חלק מתאי הגוף. מה שמשתנה בתא הסרטני הוא דגם ייצור החלבונים. אם תא רגיל מייצר חלבונים מסויימים בכמויות מסויימות, התא הסרטני ייצר חלבונים אלו בכמויות אחרות. תאי T מסוגלים "לבקש" מהתא הסרטני תעודת זהות. אם הם מזהים תא חולה או מודבר בוירוס, הם מחוררים את התא על ידי כדורים (פרפורין).

תעודת הזהות של התא נקראת MHC. צורתו כמגש שמופיע על פני השטח של כל התאים שלנו בגוף חוץ מתאי דם אדומים. על החלבון MHC יש פפטיד בגודל של כ9 חומצות אמינו שמקורו מחלבון תוך-תאי. החלבון התוך-תאי יכול להיות חלבון שמתבטא יותר (כמו במקרה של תא סרטני). דגם החלבונים בתא סרטני משתנה, והפפטידים שנגזרים מהחלבונים של התא מופיעים בצורה שונה על פני התא. תא הT מגיע ונקשר לMHC על ידי T-Cell Receptor (לכל תא T בגוף יש כזה). אם הפפטיד רגיל, תא הT עוזב. אם הפפטיד סרטני, תא הT תוקף את אותו תא.

ה T-Cell Receptor דומה לחלבוני IGG באזורים מסויימים: יש להם צורת קיפול שנקראת Imunoglobin Fold (קיפול אימונוגלובוליני) שמבוסס על 2 משטחי בטא אחד מול השני (אנטי-פרלל).

אנזימים (החומר נמצא בפרק 11 בספר)

אנזים הוא חומר שמשמש כקטליזטור (זרז) של תגובה כימית – בד"כ נמצא בתאים חיים. סוג אחר של זרזים נקרא Rybozimes שפועלים בדומה לאנזימים.

זרז גורם להאצה של תגובה כימית מבלי שהוא בעצמו עובר שינוי. רוב הזרזים הביולוגיים הם אנזימים. אנזים פועל על מצע (סובסטראט). אנזימים מסוגלים להאיץ ריאקציה בכמה סדרי גודל – פי 100, פי 1000 ואפילו פי מיליארד!

האנזים אינו משתנה, ולכן יכול להשתתף בתגובות נוספות. ריכוז קטן של אנזים יכול להיות בעל השפעה גדולה מאוד על תגובה כימית.

אנזים לא משנה את שיווי המשקל של התגובה הכימית – הוא מזרז אותה, אך שיווי המשקל נשאר אותו הדבר.

בתגובת פירוק של מיי חמצן H2O2:

אם נוסיף יון ברזל, הוא יזרז את התגובה פי 1000. אם נוסיף אנזים קטלז, הפירוק יהיה מהיר פי מיליארד!

דוגמא נוספת ליעילות אנזימים: פפטיד קטן שיכול להיות מפורק על ידי פפסין בתוך כשעה. ללא אנזים, הפירוק יקח חודשים.

כל תגובה כימית צריכה לעבור מחסום אנרגיה כדי שתצא לפועל (דלתא G צריך להיות שלילי). האנזים מוריד את אנרגיית האקטיבציה של תגובה כימית. בגלל שמדובר בתגובה כימית, גורמים כמו PH וטמפרטורה משפיעים: חימום יכול לעזור עד לנקודה אופטימלית שבה האנזים עובד בשיא היעילות. אם נחמם יותר מנקודה זו היעילות תרד בגלל דנטורציה. שיווי המשקל לא משתנה – הכל קורה אותו הדבר רק יותר מהר.

לכל אנזים יש PH אופטימלי. אנזימים מסוגלים להבדיל בין איזומרים אופטיים, לדוגמא, בין ח. אמינו L או D.

מצב מעבר ומצב ביניים

הרבה אנזימים מסוגלים לפעול על ידי כך שהם משנים את הסובסטרט למשהו שנמצא במצב ביניים. מצב הביניים הוא בעל אנרגייה חופשית נמוכה (לא נמוכה כמו התוצר, ויותר נמוכה מהסובסטרט). במצב ביניים האנרגייה החופשית נמוכה.

האנזים מפרק את הגבעות לשני חלקים (בגרף במצגת) ואז יותר קל לו לעלות ולרדת.

פעילות האנזים חשובה בכך שהוא מסוגל לתווך יצירה של חומר במצב ביניים שהאנרגייה החופשית שלו נמוכה יחסית.

האתר הפעיל (איך אנזים עובד?)

הסובסטרט מתאים בדיוק לאתר הפעיל (המקום בו מקוטלזת התגובה הכימית) של האנזים. זהו מודל ישן ולא מדוייק.

תיאורית ההתאמה המישורית (Induced fit model)

הסובסטרט והאנזים מתאימים את עצמם אחד לשני. האנזים מצוי במצב שאינו נצאים בדיוק לסובסטרט. כאשר הסובסטרט נקשר לאנזים הוא משנה את צורת האנזים. שינוי בקונפורמציה גורם להתחברות הנכונה של אתרים פעילים בתוך האנזים, מה שמעודד תגובה אנזימטית. כאשר התוצר משתחרר האנזים חוזר לצורתו המקורית.

אקסוקינאז – אנזים שהופך גלוקוז לגלוקוז-6-פוספט (שלב מס' 1 בגליקוליזה). הסובסטרט שנכנס לאקסוקינאז משנה את צורתו כדי להתאים עצמו.

הפעלת אנזים לא פעיל (זימוגן) על ידי חיתוך קשר פפטידי ספציפי.

יש חלבונים שצריכים לעבור שפעול. השפעול נגרם על ידי הידרוליזה של קשרים בחלבון שיוצרת אנזים פעיל.

ביוכימיה – הרצאה (16.3.08)

שיעור #15

הHill לא מבטא את חוזק הקישור. מקדם Hill הוא מדד לקואופרטיביות של התהליך – עד כמה קישור של מולקולת חמצן ישפיע על הקישור של המולקולה הבאה של חמצן.

מצב שנקרא DeOxy ומצב Oxy.

במצב Deoxy אין חמצן קשור להמוגלובין. במצב Oxy חמצן קשור להמוגלובין.

במצב Deoxy ההמוגלובין נוסע מהרקמות לריאות. במצב Oxy ההמוגלובין מסיע את החמצן מהריאות לרקמות. מצבים אלו הם הפיכים.

יש מצב המוגלובין שמתרחש כשנושמים גז COCarbon Monoxy. גז זה נקשר להמוגלובין יותר חזר מאשר חמצן. הרעלת CO היא מצב שבו ההמוגלובין נושא CO במקום חמצן, ומוביל למוות כתוצאה מחנק.

במצב של מעבר מoxy ל Deoxy, יש איזשהו ציר. בהשוואה בין שני מצבים אלו, אלפא-1 ובטא-1 מסתובב בזווית של 15 מעלות ביחס לאלפא-2 ובטא-2.

במצב Deoxy יש דבר חשוב נוסף: הC-טרמינל של התת יחידה בטא-2 לעומת C-טרמינל של בטא-1 נמצא בין חומצות האמינו 38 ו-41 של תת היחידה אלפא שנמצאת ליד. כאשר עוברים למצב Oxy הזנב מתרחק בצורה משמעותית מהחומצות 38 ו41.

אם מסתכלים על מצב הDeoxy טבעת ההם לא ישרה (לא מישורית) - הברזל שקשור להיסטידין הפרוקסימלי F8 נמצא מעליה. כאשר החמצן נקשר, מדברים על מצב של Transition (מצב מעבר). כשהחמצן נקשר הטבעת הופכת להיות ישרה (מישורית). כשהטבעת הופכת למישורית נוצרת הפרעה סטרית, והיא נוגעת בואלין FG5. הואלין זז כתוצאה מכך ימינה. מתזוזה זו אפשר למדוד שינוי של ההיסטידין ושל הברזל שקשור לחמצן. במצב הזה ההיסטידין מוטה 8 מעלות שמאלה. לבסוף, כתוצאה מקישור החמצן לברזל הם נמצאים על אותו ציר ורואים תזוזה של המבנה למצב הOxy.

אירוע נקודתי משפיע על כל מבנה ההמוגלובין. החמצן יכול לגרום לשינוי מבני בהמוגלובין כאשר הוא נקשר אליו.

בניסוי שעשו החליפו בהמוגלובין את ההיסטידין F8 בחומצת האמינו גליצין (מוטציה נקודתית מכוונת = SDN).

תיאורטית, אם אין קישור בין ההיסטדין לשרשרת ההליקס F, לא תהיה תזוזה.

כדי לבדוק זאת – הורידו את ההיסטדין והחליפו בגליצין. מבחינה כימית, צריך למצוא דרך לייצב את הברזל.

המולקולה Imidazole, שדומה בתכונותיה להיסטדין, נקשרת לברזל אך אינה נקשרת לשרשרת. מה שראו, זה שכאשר חמצן נקשר לברזל ולטבעת ההם, אין תזוזה של הF. מכך הסיקו שחייבים את ההיסטדין, ושאחד השינויים שהחמצן גרום להם הוא הזזת ההליקס F.

יש שני מודלים (ואחד נוסף בספר) לגבי קישור החמצן להמוגלובין ושינוי המבנה של תתי היחידות ממצב Deoxy למצב Oxy:

1. מודל KNFKoshland, Nemethy & Filmer – לפיו אין חמצן באיזור וכולם במצב עגול. לאחר שחמצן מופיע ונקשר, הוא מייצב את מצב הoxy של ההמוגלובין ויוצר צורה של משולש במקום עיגול. מצב זה מעודד את התתי יחידות האלו שאינן קושרות חמצן, שליד אלו שקשרו חמצן, לעבור למצב מעבר לקראת מצב ה Oxy. זהו מצב Sequence.

2. מודל ConcertedMWC – Monod Wyman & Changeux – כולם מראש נכנסים לאותו מצב. במודל זה, בצורה הטבעית, בחלק קטן מהזמן, מולקולות ההמוגלובין הופכות למצב של Deoxy לחלקיק שניה. תמיד חלק מהמולקולה יהיה במצב Oxy כלשהו.

ROxy

T = Tense - Deoxy

יכול להיות שהתא במצב T אך עדיין קושר חמצן. החמצן ייקשר לT אך בצורה חלשה מאוד.

באינטראקציה בין המוגלובין לחמצן - כאשר הPH יורד, החמצן קשור חלש יותר להמוגלובין. בריאות יש אחוז גבוה של רוויה של קישור חמצן.

PH באזור 7.6, אחוז הרוויה הוא 70% ו30% השתחרר.

PH של 7.2, אחוז הרוויה הוא כ50% ו50% השתחרר.

ככל שהPH יודר, הזיקה של החמצן להמוגלובין יורדת.

ההיסטדין 146 שנמצא בקצה תת היחידה בטא, מסוגל ליצור גשר מלח עם החומצה האספרטית מס' 94 כל עוד הוא טעון חיובית. זה קורה במצב Deoxy.

במצב Oxy אין יצירת גשר מלח. הגשר מלח מייצב את הצורה הטעונה של ההיסטדין, ולכן הPKa של ההיסטדין עולה במצב Deoxy.

חשוב לזכור: פרוטונציה של היסטדין 146 מייצבת את המצב הdeoxy.

עליה בריכוז הפרוטונים גורמת לירידה בPH, ויש שחרור מוגבר יותר של חמצן.

יצירה של חומצה לקטית תוריד את הPH (כתוצאה ממאמץ יתר) גם גורמת לשחרור חמצן ברקמות.

Hb-4O2 + nH+ <---> Hb-nH- + 4O2

ההשפעה של הפרוטונים איננה רק על ההיסטדין (יש ח. אמינו נוספות שמושפעות מהשינוי בחומציות) אך אנו נתייחס רק להשפעה על ההיסטדין 146.

האפקט של שחרור חמצן מוגבר נקרא אפקט בור (Bohr Effect).

איך הCO2 מגיע לריאות ויוצא?

הCO2 לא נקשר באותו אתר של החמצן. הוא יכול לעבור בדיפוזיה בדם. ביקרבונט נמצא בדם ומגיע עד הריאות, ובריאות מתבצעת תגובה לכיוון ההפוך והCO2 משתחרר.

ש תגובה חשובה שנקראת קרבמאט: CO2 שהפך לביקרבונאט יכול להקשר ישירות להמוגלובין. בשרשרת הפוליפפטידית של ההמוגלובין שיירים של +NH3 שפוגשים ביקרבונאט, הH והO נופלים ונוצר קרבמאט: -NCOO. נוצר גם פרוטון וגם מים. הפרוטון מוריד את הPH ברקמות, מה שמגביר את אפקט בור.

צורה הקרבמאט מיוצבת במצב Deoxy, וכאשר מגיעים לריאות ויש מעבר ממצב Deoxy לoxy התגובות הולכות לכיוון קליטה של פרוטון ומים, עליה בPH ויצירה של ביקרבונטא שיחל את התהליך שוב. הCO2 בריאות ישתחרר, וכך הוא מסולק.

לאנשים מעשנים יש רמות גבוהות של BPG בגוף – Bisphosphoglicerate.

זו תרכובת שנקשרת למצב Deoxy של המוגלובין ומייצבת אותו. מצב זה מעודד שחרור חמצן. מתברר שבמקומות גבוהים הגוף מרגיש בזה, ומייצר BPG בדם.

בריאות עדיין נוכל לקלוט חמצן, אך ברקמות יש פחות חמצן, ולכן יש יעול של שחרור החמצן בעזרת ייעול המצב הdeoxy.

Fetal Respiration

ההמוגלובין של העובר שונה מזה של אדם בוגר – הוא מורכב מ2 שרשראות אלפא ו2 שרשראות גמא (במקום בטא). הגמא פחות מושפע מהBPG ולכן הוא יותר במצב Oxy והוא יוכל לקחת חמצן מאימו בקלות (אפיניות גבוהה).

במהלך ההיריון יש הרבה שרשראות אלפא, הרבה גמא ומעט בטא. לאחר כ9 חודשים אין יותר גמא בדם של אישה הרה.

יום שני, 17 במרץ 2008

ביוכימיה – הרצאה (11.3.08)

שיעור #14
הערה: המבחן לשתי הקבוצות (ביוטכנולוגיה וביולוגיה) יהיה משותף!

נושא ההרצאה: המשך המבנה הראשונ, השניוני והשלישוני.

כיצד ניתן לחזות איך החלבון שמקודד לDNA נראה?
את המבנה השלישוני קשה לקבוע.
משתמשים באלגוריתמים כדי לקבוע את המבנים. למבנה שניוני יש סקלות שעוזרות לנבא מה הם הסיכויים שח. אמינו אחת תהיה מבנה א' ולא מבנה ב'. אם אף אחת משלושת האפשרויות (אלפא-הליקס, משטח-בטא, או TURN) לא מתקיימת...
אנו קובעים ציון כלשהו לכל מבנה (למשל גליצין וואלין) ומשתמשים בטבלה להצגת הציונים של כל מבנה באזור ספציפי של החלבון.
אם הציון של אלפא-הליקס גבוה יותר, למשל, אז אנו מניחים שזה יהיה המבנה עבור האזור הספציפי שאליו התיחסנו. זה נקרא ניבוי, או Prediction.

עבור BPTI, הצליחו לנבא את המבנה השניוני בעזרת אלגוריתמים. אם משווים את הניבוי למבנה האמיתי, רואים שהם דומים מאוד.
כדי לנבא את המבנה השלישוני, משתמשים במבנים דומים (ברצף) שכבר נפתרו.
יש הרבה קבוצות שבונות תוכנות מחשב שמנסות לפענח מבנים של חלבונים לפי מודלים שכבר נפתרו והאלגוריתם שלהם נשמר בסוד.

סיכום פרק 6
ידוע שיש כמה רמות מבנה. הרמה הראשונית היא רצף ח. האמינו.
רצף המבנה השניוני הוא אלפא-הליקס או משטחי-בטא. המבנה השלישוני הוא התארגנות השרשרת הפוליפפטידית במרחב.
המבנה הרבעוני הוא התארגנות של תתי יחידות (בפרק הבא).
מבחינת מבנה שניוני, יש מס' קטן של מבנים מותרים מבחינה סטרית, והם מיוצבים על ידי קשרי מימן.
לחלבונים גלובולריים יש פנים הידרופובי וחוץ הידרופילי.
התרמודינמיקה של הקיפול שלהם תלוי בדינמיקה והאנטרופיה של המערכתץ חלבונים קטנים נוטים להתקפל לבד וחלבונים גדולים צריכים עזרה מצ'אפרונים – חלבונים שעוזרים לחלבונים אחרים להתקפל בתא ומונעים דנטורציה ואגרגציה שלהם.
דנטורציה של חלבונים יכולה להגרם על ידי עליה בטמפרטורה או שינוי בPH.
הסיכוי לניבוי של מבנה שלישוני של חלבון גדול יותר אם מתבססים על מבנה ידוע של חלבון קיים, אך הוא עדיין לא ודאי (נכון להיום).

גלובינים
אורניזמים רבים בטבע זקוקים לחמצן במטבוליזם שלהם. יש אורגניזמים פשוטים שלא צריכים העברה אקטיבית של חמצן (חרקים, למשל). אורגניזמים גדולים ומורכבים יותר צריכים להעביר חמצן לכל חלקי גופם בהעברה אקטיבית.
תפקיד החלבונים ממשפחת הגלובינים (מיוגלובין והמוגלובין) הוא לקשור חמצן.
המיוגלובין (נמצא ברקמות) אוגר חמצן לעת צרה.
ההמוגלובין מעביר החמצן מהריאות לרקמות.

המבנה
המבנה של המיוגלובין ושל ההמוגלובין דומים. הם בנויים מ8 אלפא-הליקס (כל אחד). הסלילים שלהם נקראים A, B, C... H.
70% מהשרשרת הפוליפפטידית היא במבני אלפא-הליקס. אין מבנה הרבעוני של מיוגלובין. לעומת זאת, המבנה הרבעוני של ההמוגלובין הוא של 4 תת יחידות, ש2 מהן הן תת יחידות שלפא, ו2 הן תתי יחידות בטא.
התתי יחידות דומות בינהן, וגם דומות למבנה המיוגלובין.
ההמוגלובין גודלו כ150 ח. אמינו לכל תת-יחידה (כ600 ח. אמינו סה"כ) כאשר כל תת יחידה יכולה לקשור רק מולקולת חמצן אחת (O2).
קבוצת הHEME (קבוצה פרוסטטית) היא קבוצה כימית שאינה מהווה חלק מהחלבון אך נמצאת בחלבון. הקבוצה הזו בנויה
יש משפחה גדולה של תרכובות שנקראות פורפירינים. אחד החלבונים במשפחה זו נקרא פורפין. כאשר מבצעים שינויים בטבעת כלשהי, החלבון הופך לפרוטופורפרין-9. אם מורידים 2H ומוסיפים ברזל, מקבל פרופרוטופורפרין (או קבוצת ההם = HEME). המבנה הזה הוא בעל צבע, וכאשר הוא מתחבר לברזל צבעו אדום. עם מגנזיום צבעו יהיה ירוק (בכלורופיל). עם נחושת הוא יהיה כחול.
הברזל יכול ליצור 6 קשרים: 4 נוצרים עם הטבעת הפרוטופורפירינית, קשר נוסף נוצר עם ההיסטידין שנמצא בהליקס F8 או היסטידין 93. החמצן לא קשור בצורה קוולנטית בגלל הקונפיגורציה. הוא מיוצב על ידי טבעת הN והברזל.
היסטדין נוסף מייצב את החמצן בצד השני והוא נקרא E7 או היסטדין 64.
להיסטדין הקרוב יותר (היסטדין 93) לטבעת הN קוראים PROXIMAL.
להיסטדין הרחוק יותר קוראים DISTAL.

כאשר החמצן צריך להשתחרר הוא עובר ממקום למקום בתוך הסביבה של טבעת הn וההליקסים – זהו תהליך דינמי שבו החמצן עובר ממקום למקום (ב"קפיצות") עד שהוא יוצא.

תהליך הקשירה של החמצן למיוגלובין (MB)
Mb + O2 --> MbO2

מגדירים את הערך [טטא]: שיעור תפוסת המיוגלובין על ידי החמצן.
טטא הוא מספר האתרים התפוסים (SITES OCCUPIED) חלקי סה"כ האתרים האפשריים (TOTAL AVAILABLE SITES).

[להעתיק משוואות מהמצגת]
חוק הנרי: הריכוז של גז מסויים שמומס בתוך נוזל הוא פרופורציונאלי לריכוז אותו גז שנמצא מעל הנוזל.
לכן, אפשר להגדיר את טטא כלחץ החמצן חלקיי לחץ חלקי של חמצן שגורם ל50% מהמיוגלובין להיות תפוס + לחץ חלקי של המערכת.

תהליך הקשירה צריך להיות יעיל (בגלל שיש צורך לאגור את החמצן).
כפי שניתן לראות בגרף, כבר בריכוזים נמוכים של החמצן המיוגלובין תופס אותו חזק (תפוסה גבוהה).

[להעתיק גרף מהמצגת]


להמוגלובין יש 4 תתי-יחידות.
אם מסתכלים על גרף של קשירה חזקה שלו לחמצן, נוכל לשחרר רק חלק קטן ממנו (כ10% מכלל שיעור ההמוגלובין התפוס) וזה תהליך לא יעיל.
אם הקשירה תהיה חלשה, ההמוגלובין יוכל לשחרר חמצן בקלות ברקמות אבל בריאות הוא ישחרר רק כ50%-60% ולכן גם אז זה לא יהיה יעיל.
הפתרון הוא קשירה חזקה בריאות וקשירה חלשה ברקמות.
העקומה, שמתעקמת בצורה סיגמואידלית (שצורתה S), מגדירה מושג שנקרא קואופרטיביות – אינטראקציה קואופרטיבית.
בתתי היחידות כל אחת עוזרת לשכנתה להבין מהי הצריכה של קישור החמצן באותו הרגע.
הקואופרטיביות אומרת שתתי היחידות ירצו לקשור חמצן (אם אחת משחררת חמצן, האחרות גם ישאפו לשחרור חמצן).
התנהגות קואופרטיבית היא חלק מאפקט רחב יותר בביוכימיה שנקרא האפקט האלוסטרי (שאומר שקישור של ליגנד לחלבון משפיע על האפיניות של שאר תתי היחידות או אתרי הקישור במולקולה).

עקומת היל – Hill Plot
בקישור ההמוגלובין לחמצן, בציר הX יש LOG של הלחץ החלקי של החמצן.
בציר הY יש טטא חלקיי 1 חלקיי טטא.
הטטא בהמוגלובין נתונה על ידי לחץ חלקי של חמצן בחזקת n חלקיי לחץ ב50% בחזקת n + לחץ חלקי בחזקת n.
ניתן להפוך את המשוואה הזו למשוואה עם LOG.

[משוואות מהמצגת]

הn הוא השיפוע של גרף היל. בהמוגלובין הוא שווה ל1.
במקרה של המוגלובין הn משתנה לאורך לחצים שונים של חמצן. משמעות שינוי השיפוע היא הזיקה לחמצן.
קישור החמצן הראשון מתנהג כשיפוע של 1. השיפוע משתנה ויכול לעלות עד כ3.5 .
במצב הזה, קישור לחמצן השני והשלישי מתבצע בזיקה חזקה יותר מאשר הקישור של החמצן הראשון.
למולקולה של 3 חמצנים יש אתר קישור אחד שנותר, ובמצב כזה השיפוע גם יהיה 1.
למצב שבו השיפוע הכי חזק, כ3.5, קוראים מצב מעבר.
המצב ההתחלתי שבו השיפוע 1 נקרא מצב קישור חלש.
המצב האחרון שבו השיפוע גם 1 נקרא מצב קישור חזק.