ביוכימיה - הרצאה (26.2.08)

שיעור #10

תרגום

הריבוזום מתיישב על שרשרת הmRNA ויוצר שרשרת של ח. אמינו - פוליפפטידים. שלושה נוקליאוטידים נקודדים לח. אמינו אחת המתאימה.
בחיידקים הקודים לפעמים שונים מעט מאלו של בני אדם, אך באופן כללי הקוד נשמר במהלך האבולוציה.
הtRNA היא מולקולת RNA שבקצה התחתון שלה יש לולאה ואנטי-קודון שנקשר לmRNA.
הtRNA מביא את החומצה האמינית המתאימה לmRNA.
כדי להתחיל שרשרת פפטיד, יש קוד AUG שמקודד להתחלת התהליך באאוקריוטים. בפרוקריוטים N-Formylmethionine יושב על הtRNA. הפורמיל יורד ורק הח. אמינו מתיונין נשארת. קיים מנגנון שיכול להחליף את המתיונין.

בחיידקים:
ב Lac-Operon יש שלושה גנים. לאחר יצירת mRNA שמכיל את שלושת הגנים, צריך ליצור מהם חלבונים. בLac-Z יש קודון התחלה, וגם בLac-G ובLac-A.
בLac-Z ובLac-G יש רצף AUG. לפני הרצף הזה, קיים רצף עשיר בבסיסי A וG, שנקרא גם Shine Dalgarno Sequence.
שלושה ריבוזומים מתרגמים את הmRNA לפני כל רצף AUG עד אזור הStop Codon.
הStop Codon מפיל את הtRNA ולא מאפשר לו להמשיך - גם הריבוזום נופל.
מאותו הmRNA נוצרים חלבונים שונים.
רצף הShine Dalgarno נמצא כ10 בסיסים upstream ביחס לגן.

תת היחידה בקטנה של הריבוזום, היא הכ16s-Robosomal-RNA. לחלק זה יש רצף ספציפי שקושר את הריבוזום לmRNA ע"י זיהוי של רצף הShine Dalgarno.
בגנים שונים, ה16s יכול להיות שונה כדי להכיר רצפים שונים בmRNA.

tRNA

צורתו של הtRNA היא תלתן. זו מולקולה חד-גדילית שמתקפלת על עצמה ויוצרת מבנה של Stem-loop. אחת הלולאות האלו היא האנטיקודון שמזהה את הקודון על הmRNA.
על מולקולות הtRNA מסתיימות ברצף "CCA" בקצה ה3'.
מבנהו התלת מימדי שמור אך האנטי קודון שונה בהתאם לרצף על הגן. יש כמה נקודות קבועות בtRNA. מולקולה זו עוברת הרבה מודיפיקציות (ביגור) שמשנות את הנוקליאוטידים.
אחת מהן היא פסוידו-יורידין, למשל.
אזור הstem loop, האנטי קודון, הוא האזור היחידי שמכיר את הmRNA.

האנזים אמינו-אציל-tRNA-סינתאז מבצע את תהליך חיבור ח. האמינו לtRNA.
הוא לוקח ח. אמינית ומאקטב אותה ע"י ATP. הATP מתחבר לח. האמינית ונותן אמינו-אציל-אדנילאט. בקשר הפוספט של ATP משתמשים לחיבור ח. אמינית.
הפירופוספט (שתי מוקולות פוספט שמשתחררות) מתפרק לשני פוספטים בודדים ומשחרר הרבה אנרגיה.
הח. האמינית הטעונה יכולה להתחבר לtRNA. בA האחרון של הCCA יש קבוצת הידרוקסיל. הח. אמינית מתחברת לOH ע"י קשר קוולנטי.
המולקולה החדשה היא אמינו-אציל-tRNA. שתיים או שלוש פריים.

האנזים שמלביש את חומצת האמינו סרין על הtRNA יודע לזהות 4 סוגי tRNA (שכל אחד מהן מקודד לסרין).
לא קיים אנזים tRNA-סינתאז עבור N-פורמיל-מתיונין שמצמיד אותו לtRNA אלא חלק מהtRNA עובר התמרה ע"י הוספת פורמיל. חלק מהכרת המולקולה נעשית בזכות ההתמרות.
קיימת גם יכולת בדיקה עצמית של האנזים (Proof Reading) ותיקון במקרה הצורך.
UAC בmRNA מכיר את הGUA בtRNA.
מוטציה יכולה להוביל לשיבושים בתא. לחיידק יש יכולת לדלג מעל קודון בעזרת שימוש במוטציה: במקום GUA הוא יוצר CUA באנטי קודון של הtRNA. אמנם בmRNA יש UAG, אבל הtRNA המתאיםלו גם יביא טירוזין ונקבל מולקולה תקינה.
בדרך זו, על ידי שתי מוטציות בלבד בtRNA, שמביא את הטירוזין לmRNA מקבלים חלבון עם ח. אמינו נכונה בסופו של דבר. תהליך זה נקרא Supressor-Mutation.

אנטי קודון

שני הנוקליאוטידים הראשונים בtRNA חייביים להתאים לנוקליאוטידים בmRNA. במקום השלישי (שנקרא גם "wobble") יכול להופיע U במקום G, למשל, מכיוון שבהרבה מקרים הוא לא משפיע כל עוד שני הנוקליאוטידים הראשונים מתאימים. הסיבה היא, שהרבה חומצות אמינו בעלות שני נוקליאוטידים ראשונים זהים מקודדות לאותה ח. אמינו כאשר לא משנה מה הוא הנוקליאוטיד השלישי .

בפרוקריוטים, תת היחידה הגדולה, 50S, של הריבוזום מורכבת מ23s ו-5s, ו 31 חלבונים בנוסף לכך. החלבונים נקראים L1 עד L31.
תת היחידה הקטנה מורכבת מ 16s, שגם היא מורכבת מתוספת של חלבונים, 21 חלבונים: S1 עד S21.
לתת היחידה הקטנה קוראים 30S.
צפיפות שתי היחידות ביחד היא 70S (היחידות אינן לינאריות, ולכן לא מהוות חיבור של שתי תתי היחידות).

המבנה של הrRNA, הוא חד גדיל של RNA שמקופל בStem Loop. המבנה השלישוני שלו מאפשר לו כניסה לריבוזום ולאתר את רצף הShine Dalgarno הספציפי. צורת הקיפול (המבנה השלישוני) שמורה באבולוציה, למעט יצורים מסויימים שקיפול ה16S שלהם שונה.
23s-RNA הוא גדול יותר ויוצר מבנה מיוחד. ה5s קטן ממנו.
תת היחידה 50s מביאה את הtRNA פנימה, וממנה יוצאת השרשרת הפוליפפטידית.
בחיידקים הmRNA מיוצר ממכיוון 5' ל3', והריבוזום יכול להתיישב על ה5' כך שהתרגום יכול להתבצע במקביל לשעתוק. סינתזת החלבון היא מהקצה הN-טרמינלי לקצה ה C-טרמינלי.
בתוך הריבוזום, הtRNA מתמקם באתר A (נקרא A-Site, או אמינו-אציל-tRNA). לידו יש P-Site
P = Peptidil, ואתר יציאה E-Site, שממנו הtRNA מתנתק ויוצא החוצה.

Initiation
30s ו50s צריכים לתרגם mRNA. ע"י פקטור IF3, שנקשר ל30s, הקשר בינהם מופרד (חייבת להתבצע הפרדה כדי שתהליך התרגום יוכל להתחיל להתבצע).
בשלב הבא (שמתבצע במקביל), צריך להגיע הtRNA-פורמיל-מתיונין (הראשון) לmRNA:
פקטור הבנוי מ IF1 ו- IF2 נקשר לGTP ונושא עימו גם N-פורמיל-מתיונין-tRNA.
הGTP (מולקולה מקבוצת G-Proteins) משחררת אנרגיה ומאפשרת את התהליך.
הקשר בין tRNA לmRNA הוא ללא תלות בתת יחידה הגדולה. נוצר קומפלס לmRNA, tRNA, פקטורי IF1, IF3, ו-50s.
ה IF1 וIF3 מונעים מtRNA אחר לבוא ולהתחבר. כל הקומפלקס הזה נקרא Initiation Complex ומאפשר את התחלת התרגום.
בהמשך, נפרדים IF3 וIF1 ותת היחידה הגדולה 50s מתווספת. GTP משתחרר והופך לGDP שמשנה את מבנה תת היחידה הקטנה, ועכשיו היא יכולה להתחבר לתת היחידה הגדולה, ומתקבל קופלקס חדש - 70s.
הIF2 משתחרר במקביל להגעת ה50s.

תהליך הElongation

בקצה הN-טרמינלי יש N-פורמיל-מיונין. פקטור EF-TU (שמחוברת לו מולקולת GTP, וtRNA מתאים) מביא את הmRNA.
באתר הA-Site הריק, tRNA מתאים מתיישב בפנים בזכות הפקטור EF-TU. בתהליך משתחררת מולקולת GTP והופכת לGDP, ועוזרת לtRNA למצוא את מקומו.
הGTP שהופך לGDP משחרר הרבה אנרגיה, וע"י פקטור נוסף, EF-TS, שגם אליו מחוברת מולקולת GTP, הוא מסלק את הGDP שעל הEF-TU, ומתקבל קומפלקס חדש של EF-TU שמחובר לEF-TS.
ה EF-TS יורד, וה EF-TU נשאר עם מולקולת GTP.
את הח. אמינו שיש לחבר לשרשרת שנוצרה יש להוסיף לקצה הC-טרמינלי של הפפטיד.
הפפטיד "קופץ" מאתר P לאתר A, ומתחבר לחומצת האמינו ע"י פעילות אנזימטית מתוך התת יחידה של הריבוזום (פפטיטין-טראנספראז). קיבלנו פפטיד ארוך יותר בח. אמינו אחת (1+).
בתת היחידה הגדולה שבריבוזום,האנזים שמבצע את הפעילות הכימית הוא RNA (או Rybozime).

ביוכימיה - הרצאה (24.2.08)

שיעור #9

לא ידוע אם יש הליקאז לפני RNA-פולימראז-3. לפני RNA-פולימראז-2 קיים הליקאז.
מלבד הפקטורים הבסיסיים (Basal Factors) בכל פתיחה של גן עבוד RNA-פולימראז-2, יש כאלו ספציפיים לרצף מסויים באזור הפרומוטור. בנוסף ל TATA Box, לגן כלשהו יהיה פקטור מסויים. הפקטור הזה מגביר את התדירות שהפרומוטור שולח לפולימראז, כך שהוא יוציא mRNA בתדירות גבוהה יותר.

פקטורי השעתוק האלו קשורים לאקטיבטורים ולרפרסורים (כולם קשורים זה לזה בצורה כלשהי) ולPre Initiation Complex.
פקטור שעתוק מכיל אזור שקושר DNA - זהו אזור חלבוני שנקשר לMajor Groove ונצמד אליו ע"י כך שהו מזהה רצף פנימי בתוכו. הוא נקשר כדימר (זוג חלבונים) לDNA. אזור זה בפקטור השעתוק נקרא DNA Binding Domain.
החלק השני, הActivation Domain, אינו קושר DNA, אבל קושר חלבונים אחרים - פקטורי שעתוק אחרים או אקטיבטורים. הקשרים האלו יוצרים את הפעילות האקטיבית של הפרומוטור.
שני פקטורים יכולים להשפיע ביחד ברמה של מכפלת היעילות של שניהם (אם אחד מגדיל את היעילות פי 5, והשני מגדיל את היעילות פי 10, אז שניהם ביחד מגדילים את היעילות פי 50).

הגן ציקלין-D1 קשור למחזור התא; הבקרה על הביטוי שלו מאוד ייחודית. פקטורים מסויימים יכולים לגרום לייצור עודף שלו, ואחרים יכולים לגרום למוטציות שמבטלות אותו או גורמות לבעיות.

אופן הקשירה לDNA
קיים מבנה ספציפי יודע לקשור את החלבון.
בחלבון יש אזור שנקרא Zinc Finger שיודע לקשור את הDNA.
חלבון מסוג כזה הוא TF3A. ע"י הכנסת יון אבץ לתוך סליל של חומצת אמינו, נוצרת מעין לולאה בצורת אצבע (שמורכבת מHis ו Cys). האצבע נכנסת לMajor Groove בDNA ונקשרת אליו. זהו למעשה הDNA Binding Domain.
לחלבון אחד יכולות להיות כמה אצבעות שנקשרות לDNA במקומות שונים. השיירים שנמצאים על האצבע הם אלו שמבצעים את פעולת הקשירה.

Helix-Turn-Helix - זהו מבנה בחלבון שיכול להקשר לDNA. שני סלילי-אלפא (α helices) המופרדים ע"י רצף קצר של חומצות אמינו.
Helix-Loop-Helix - מבנה שמופיע בד"כ כדימר - שני "מקלות" שנקשרים לDNA משני הצדדים.
Leucine-Zipper - (לאוצין היא חומצת אמינו) - שני "מקלות" הצמודים זה לזה ע"י "ריצ'ראצ'" של לוצינין אחד ליד השני. כל חומצת אמינו שביעית ברצף, בערך, היא לוצין.

Elongation

RNA-פולימראז-2 לפעמים מנסה לשעתק ולא מצליח, ומתחיל שוב את התהליך מההתחלה.
ח. האמינו סרין יכולה לעבור פוספורילציה (יש רק עוד 2 ח. אמינו נוספות שיכולות לעבור פוספורילציה מלבד סרין).
RNA-פולימראז-2 צריך לעבור בקרה כדי לעבור מתהליך הInitiation לElongation, והוא Hypo-phosphoralization. הסרין אצלו, שממוקם בזנב, צריך לעבור זרחון. הפולימראז לא יכול להתחיל להאריך את השרשרת לפני שפקטור נוסף מזרחן את סרין 2. אחרי שסרין 5 וגם 2 מזורחנות, יצירת הmRNA יכולה להתחיל.
הRNA איננו מזורחן כאשר הוא מגיע לפרומוטור.
RNA-פולימראז-2 הראשון שמגיע נקרא Pioneer (חלוץ). אחריו יגיעו פולימראזות אחרים כאשר להם יש כבר Pre-Initiation-Complex מוכן. בסוף הגן, הRNA-פול-2 צריך סימן שיגרום לו לעצור.
mRNA שנוצר עובר עיבוד בקצה 3'של הסיגנל AAUAAA. אחריו יש מרווח של 10-30 נוקליאוטידים ואז רצף של 2 נוק': CA, אח"כ 30 נוקליאוטידים נוספים ואז רצף עשיר ב G או GU.
אנזים שחותך חלק מסויים בשרשרת, מותיר את הmRNA שמתחיל ברצף AAUAAA חשוף. כדי להגל עליו, נוספים לו 250 נוקליאוטידים מסוג A. רצף זה נקרא Poly-A-Tail או זנב פולי-A. על הזנב הזה יושבים החלבונים CstF ו CPSF. כשמגיע הרצף "AAUAAA" זהו סימן שהפולימראז הגיע לקצה הגן, ושני החלבונים האלו מתנתקים מהפולימראז ומתחברים לשרשרת הRNA בקצה ה3' שהופקה ממנו במקום.

כ 15-25 נוקליאוטידים אחרי ה AAUAAA יש חיתוך של ה RNA, והפולימראז נופל מהגן. החיתוך נעשה ע"י CPSF וCSTF.
ה Poly-A-Tail מוסיף את הרצף של 250 נוקליאוטידים מסוג "A" ואח"כ משתחרר. הוא קשור למספר גדול של חלבונים אותם הוא מצפה. חלבון הPABP - Poly-A Binding Protein הוא שנקשר לזנב הPoly-A ומצפה אותו בקצה 3': כך הוא לא יכול להאכל ע"י נוקליאזות. כל mRNA חייב להיות מוגן על-ידיו בקצה 3' שלו.
גם קצה 5' צריך להיות מוגן, וזה נעשה ע"י קבוצה של חלבונים המבצעים mRNA-Capping. הכיפה הזו, הCap, היא נוקליאוטיד ששמו 7-מתיל-גואנזין (m7G), והוא מחובר לmRNA ע"י גשר של 3 פוספטים, שבקצה ה5' שלו הm7G יושב, וכך השרשרת לא יכולה להתארך יותר. הוא מגן על הRNA מפני האקסונוקליאזות שיכולות לבצע Decapping.
הCap גם עוזר לכוון את הריבוזום אל הmRNA.
כל התהליכים האלו מתרחשים במקביל (Splicing, Capping, PolyA וכו').

Splicing

ביצורים אאוקריוטים קיים תהליך הSplicing הייחודי, שבו נחתכים רצפי אאינטרונים, והאקסונים מודבקים זה לזה (האקסונים מהווים את הרצפים המקודדים בגנום) ויוצרים mRNA בוגר. האינטרונים הם רצף אינו מקודד.
יש חלבונים שמזהים את החיבור בין האינטרונים לאקסונים. החיתוך בינהם נוצר במבנה של לולאה. חלבונים נוספים חותכים בקצה 3', וחלבונים אחרים מדביקים את האקסונים מחדש אחד לשני לפי הסדר.

אזור קונצנזוס - האקסונים הם בד"כ חלקים קטנים יותר מהאינטרונים, וניתן לנבא בערך איך יראה הmRNA לאחר הספלייסינג. חלבונים שנקראים ספלייסוזומים, המורכבים בעיקר מsnRNPs - מולקולות של חלבונים וRNA קטן, הם בעיקר אלו שמבצעים את התהליך. הספלייסוזום מורכב בעיקר מu1, u2, u3, u4, u5, u6:
u1 מתלבש בתחילת הרצף. u2 מתלבש על הBranch Point.
חלבוני הu יכולים לזהות אזורים מסויימים לפי רצף הRNA שלהם, שמתחבר לקצה ה5' של האינטרון. u1 יכול לעזוב, וu6 מתחבר במקומו - זהו מבנה דינמי.

Alternative Splicing

מנגנון הAlternative Splicing מאפשר לקבל מאותו גן צורות שונות של RNA. בתא מוח למשל, יתקבל מבנה כלשהו של RNA, ובתא כיליה יתקבל מבנה שונה.
בשני שרירים שונים גם יכולים להתקבל מבנים שונים של mRNA כתוצאה מספלייסינג שונה קצת שמותאם לסוג התא.

mRNA Editing

מצאו שיש תהליכי עריכה במקומות מסויימים- מודיפיקציה מסויימת על נוקליאוטיד בmRNA.

דאמינציה של C (ע"י האנזים דאמינאז) שהופך ל-U. אם יש קודום שמקודד לח. אמינית, הוא יכול לשנות אותו ועל כן יש לכך חשיבות גדולה.
סוג אחר של עריכה, הוא דאמינציה של A, וקבלת נוקליאוטיד חדש במקומו -I=Inozine שנמצא בRNA.
האנזים שקורא את I חושב שהוא G ולכן זה דומה להפיכת A ל-G.
ADAV - שם האנזים שמחליף את A ב-I; הוא מתיישב על הmRNA ומזהה את הA המתאים ומבצע דאמינציה עליו.
חלבון Apolipoprotein-B (בקצרה ApoB) חשוב עבור חומצות שומן. באקסון 26 יש קודון שבmRNA שלו הוא מקודד לח. אמינו גלוטמין בכבד. במעי, לעומת זאת, יש תהליכי editing שבהם דאמינציה של C ונקבל UAA במקום CAA. הרצף UAA הוא סימן לעצירה (Stop-Codon) וכך נקבל במעי הגס חלבון בעל רצף קצר יותר.

תהליך הExport: אחרי שmRNA עובר ביגור ויש לתרגם אותו, הוא יוצא דרך שוער הגרעין ומגיע לציטופלסמה - שם הוא עובר תרגום לחלבון ומתפרק.
הmRNA מצופים בחלבונים הקשורים לספלייסינג וחלקם נושרים בדרך. יש חלבונים שמלווים אותו רק עד הציטופלסמה או רק בחלק מסויים בו נמצא הmRNA.
תהליך השעתוק הוא תהליך של יצור הmRNA, שתפקידו לקשר בין הDNA ליצירת חלבונים.

תרגום - Translation

התרגום מתרחש אך ורק בציטופלסמה. ה-mRNA כבר נוצר. הריבוזום קורא מקצה 5' לכיוון 3' : קודון-קודון.
לכל קודון הוא מביא tRNA, שיש לו 3 אתרים. tRNA יושב בריזובוזום ומביא איתו ח. אמינית. הריבוזום מורכב מ2 חלקים (גדול וקטו).

הקוד הגנטי

Degenerate Code - מצב שבו יש יותר מקודון אחד עבור אותה חומצת אמינו.
קיים רק רצף אחד שמקודד להתחלה: AUG, ולעומת זאת 3 רצפים שמקודדים לסיום (Stop Codons).

ביוכימיה - הרצאה (19.2.08)

שיעור #8

מבנה הDNA הוא מעין צורה שדומה לחרוזים על שרשרת. ה"חרוזים" הם הנוקליאוזום.
חוקרים גילו כי קיים קשר בין כמויות ההיסטונים השונים - יש כמויות כפולות של ההיסטונים H2,H3,H4 יותר מאשר H1.
אורך כל שרשרת כזו הוא כ100 אנגסטרם.
כאשר לקחו DNA ארוז בנוקליאוזום והוסיפו לו נוקליאז (DNAse שחותך DNA דו-גדילי) מצאו שהוא מסוגל לחתוך רק באזורים שבין הנוקליאוזום, וכך קיבלו DNA שהחלקים שאינם חתוכים בו הם ה"חרוזים" - הנוקליאוזומים. כל גודל של ליפוף (גודל של נוקליאוזום) כזה הוא 200bp.
ע"י הוסיפת DNAse לDNA בהדרגה, וראו שלחתיכות הDNA שנוצרו היה קל יותר לנוע בתוך הג'ל, וגודל הקפיצות הוא כ200bp. הסיקו מכך שמבנה הנוקליאוזום הוא של היסטונים וזהו אורכו.
היקף הDNA מסביב ל"חרוז" הוא 145bp והלינקר-DNA הוא באורך של 55bp.

בניסוי נוסף, הוציאו את ההיסטון H1 מכרומטין. כתוצאה מכך השתבש מבנה הנוקליאוזום, והמסקנה הייתה שH1 חיוני למבנה הקומפקטי והתקין של הנוקליאוזום.
DNA ארוז בכרומוזום ומכווץ פי 10,000 יותר מאשר בצורתו הרפויה.
ביצורים פרוקריוטים אין היסטונים מכיוון שאין להם גרעין.
בתאים אאוקריוטים קיימים 3 סוגי RNA-פולימראז (RNA-פולימראז 1, 2 ו- 3).

RNA-פולימראז-1 נמצא בגרעינון ומסנתז rRNA (רנ"א ריבוזומלי). הוא עובד בעיקר על מולקולות rRNA ויש לו פרומוטור אחד. הריבוזום מתרגם את הRNA לחלבון.
18s היא היחידה הקטנה שמרכיבה את הrRNA
28s היא היחידה הגדולה שמרכיבה את הrRNA. מורכב מ2 תת-יחידות נוספות: 5.8s, 5s

באאורקיוטים יש חזרות של גנים, ובהם יש אזורים שמקודדים לrRNA השונים, בינהם יש אזורים פחות חשובים בDNA.
RNA-פולימראז-1 משעתק ממנו Pre-Ribosomal-RNA - Pre-rRNA - 45s.
אנזימי RNAse מבשילים את ה Pre-rRNA ומשאירים ממנו 18s, 28s ו5.8s בוגרים שמרכיבים ביחד ריבוזום.

הrRNA יכול לעבור מודיפיקציות (מתילציות, למשל)
מולקולות Small-RNAs שקשורות לגרעינון משועתקות ע"י פול-,2 מביאות חלבונים לrRNA ומבצעות עליו מתילציה.
ע"י כך הן תורמות לתהליך ההבשלה שלו.
*תזכורת: כדי להגיע למצב ההתחלה (initiation) יש צורך בפקטורי שעתוק - TF
RNA-פולימראז-3 - מתיישב על הפרומוטור שלפני הגן שהוא רוצה לשעתק. לשם כך הוא נעזר בTF (פקטור שעתוק, Transcription Factor) - הפקטורים הם TF3A, TF3B.
RNA-פולימראז-3 גם משעתק את rRNA 5s אשר חלק מצבר מולקולות הrRNA בגרעינון.

שעתוק של 5s rRNA
דרוש גם TF3A בזמן שעתוק של 5s כדי שיוכל לזהות את הפרומוטור. TF3A מתיישב על הגן ונמביא אליו את TF3C, ואז TF3B יכול להגיע לגן. רק אז, האנזים יכול להתחיל בשעתוק.

דרך ל"כיבוי" הגן:
כאשר נוצרות הרבה מולקולות של 5s ויש עודף שלהן, הן מתלפפות עם הTF3A והוא מתלפף ונחסם, ואינו מסוגל להתיישב על הפרומוטור - מה שגורם להפסקה של פעילות הגן.

RNA-פולימראז-2 - אצל אאוקריוטים הפרומוטור גדול בהרבה מאשר אצל פרוקריוטים ומורכב יותר, מכיוון שנקשרים אליו יותר פקטורים.
אזור שנקרא GC BOX קיים הרבה אצל גנים מסוג Housekeeping, שמבוטאים בכל הרקמות בגוף ברצף הבקרה שלהם.
אצל גנים ספציפים לרקמה מסויימת (כמו גן שמייצר גלוקוז שנמצא בכבד) מצאו רצפי TATA Box.

כדי שתהליך הinitiation יצא לפועל, הRNA-פולימראז-2 צריך ליצר קודם קומפלקס שמורכב מ GTF - General Translation Factors או BTF - Basal Translation Factors.
הTATA Box ממוקם Upstream (לפני הגן). TF2D הוא הקומפלקס הראשון שמתיישב על הTATA Box ויש בו מספר חלבונים: TBP - TTA Binding Protein, חלבון שנקשר לTATA Box.
גם TATA Binding Associated Factors שהם קבוצה אחרת של חלבונים (אין צורך בפירוט..)
TF2A מתחבר למולקולה ומחזק את הקשר. TF2B מסמן לRNA-פולימראז-2 את המקום בו הוא צריך להתיישב (לפני הגן).
TF2F מגיע ביחד עם RNA-פולימראז-2 ועוזר לו להתחבר (מושך אותו לפרומוטור).
TF2H-הליקאז פותח את הDNA כדי לאפשר לאנזים להתיישב ב"נוח".
לאחר שכל הפקטורים האלו סיימו את תפקידם, האנזים יכול להתחיל לעבוד.
CTD - C Terminus Domain - הקצה הC של האנזים ארוך כמו זנב וזהו אחד החלקים החשובים אצלו. בגלל שהרבה פקטורים יכולים להקשר אל הזנב הזה, רואים שאי אפשר להתחיל בתהליך השעתוק לפני שהCTD עובר זרחון.

TBP - (מסומן כסליל ירוק במצגת) על הTATA Domain ומקפל את הDNA. כתוצאה מהקיפול, אפשר להביא חלבונים אחרים להתיישב על הDNA. הTBP משמש תמיד כ Pre Initiation Complex גם כאשר אין TATA Box ברצף. גנים עם פחות רצפי TATA מבוטאים בצורה נמוכה.
ידוע היום שכ 2/3 מהגנים לא מכילים רצפי TATA Box. יש אתר אחר שנקרא Initiator, ובכל זאת TBP משתתף.

תאי הגוף שלנו נוצרים מתאי אב (Stem Cells). תא אב מתמיין לתא אב יותר מבוגר.
בתא צעיר (Embrionic Cell) שמו לב שאין ביטוי של β-גלובין (גן שמפיק תאי דם), ולעומתו תא דם אדום כן מבטא β-גלובין. בניסוי שנערך ביטאו קטע DNA בכל אחד מהתאים האלו וגילו שהDNA מתא הדם האדום נחתך בקלות רבה יותר מאשר התא הצעיר.
המסקנה הייתה שיש הבדל באריזת הDNA אצל תא צעיר, שעדיין אין שימוש בגנים שלו לעומת תא דם אדום שאצלו קיימת נגישות גבוהה לDNA-פולימראז-2.
DNA בעל רגישות גבוהה יותר מכונה: "DNA Hyper Sensitive Site".
אצל תא כבד, אזור הβ-גלובין דחוס מכיוון שהוא לא עושה שימוש בגן הזה, לעומת תא אדום שאצלו האזור הזה פתוח.

Chromatine Remodelling - הDNA נפתח ונסגר באזורים מסויימים. זהו נושא חדש שנמצא במחקר. יש אוסף שלם של חלבונים "רעבים" לאנרגיה שמושקעת בפתיחה וסגירה של DNA וחלק גדול מהאנרגיה בתא, הATP משמש לכך.
התהליכים האלו נעזרים בהיסטונים. קצוות ההיסטונים בולטים החוצה, ועליהם מתרחשות מודיפיקציות (למשל: אצטילציה, מתילציה, פוספורילציה, יוביקויטינציה ועוד...) בהתאם לחומצה האמינית, והן גורמות לשינויים במטענים שמכווצים או פותחים את הDNA בהתאמה.
אצטילציה על היסטין 3 יכולה להוביל לפתיחת כרומטין. מתילציה לעומת זאת מביאה לסגירה.

DNA Enchancers & Silencers - במרחק של כ100bp מהפרומוטור, יכולים להשפיע על השעתוק.
אם הDNA מתקפל ומגיע לפרומוטור, פעולת Enhancement נשעית ע"י רצף כזה מחלבון שנקרא Activator שמגביר את פעילות הפולימראז וגורם לו לעבוד מהר יותר.
אם יש צורך להשתיק אזור מסויים, התא משתמש באזור של Silencer שנמצא רחוק יחסית מהגן. גן של רפרסור משפיע על קצב פעילות הפולימראז ומכבה אותו.
Co-Activator - קומפלקס של אקטיבטור.