שיעור #8
מבנה הDNA הוא מעין צורה שדומה לחרוזים על שרשרת. ה"חרוזים" הם הנוקליאוזום.
חוקרים גילו כי קיים קשר בין כמויות ההיסטונים השונים - יש כמויות כפולות של ההיסטונים H2,H3,H4 יותר מאשר H1.
אורך כל שרשרת כזו הוא כ100 אנגסטרם.
כאשר לקחו DNA ארוז בנוקליאוזום והוסיפו לו נוקליאז (DNAse שחותך DNA דו-גדילי) מצאו שהוא מסוגל לחתוך רק באזורים שבין הנוקליאוזום, וכך קיבלו DNA שהחלקים שאינם חתוכים בו הם ה"חרוזים" - הנוקליאוזומים. כל גודל של ליפוף (גודל של נוקליאוזום) כזה הוא 200bp.
ע"י הוסיפת DNAse לDNA בהדרגה, וראו שלחתיכות הDNA שנוצרו היה קל יותר לנוע בתוך הג'ל, וגודל הקפיצות הוא כ200bp. הסיקו מכך שמבנה הנוקליאוזום הוא של היסטונים וזהו אורכו.
היקף הDNA מסביב ל"חרוז" הוא 145bp והלינקר-DNA הוא באורך של 55bp.
בניסוי נוסף, הוציאו את ההיסטון H1 מכרומטין. כתוצאה מכך השתבש מבנה הנוקליאוזום, והמסקנה הייתה שH1 חיוני למבנה הקומפקטי והתקין של הנוקליאוזום.
DNA ארוז בכרומוזום ומכווץ פי 10,000 יותר מאשר בצורתו הרפויה.
ביצורים פרוקריוטים אין היסטונים מכיוון שאין להם גרעין.
בתאים אאוקריוטים קיימים 3 סוגי RNA-פולימראז (RNA-פולימראז 1, 2 ו- 3).
RNA-פולימראז-1 נמצא בגרעינון ומסנתז rRNA (רנ"א ריבוזומלי). הוא עובד בעיקר על מולקולות rRNA ויש לו פרומוטור אחד. הריבוזום מתרגם את הRNA לחלבון.
18s היא היחידה הקטנה שמרכיבה את הrRNA
28s היא היחידה הגדולה שמרכיבה את הrRNA. מורכב מ2 תת-יחידות נוספות: 5.8s, 5s
באאורקיוטים יש חזרות של גנים, ובהם יש אזורים שמקודדים לrRNA השונים, בינהם יש אזורים פחות חשובים בDNA.
RNA-פולימראז-1 משעתק ממנו Pre-Ribosomal-RNA - Pre-rRNA - 45s.
אנזימי RNAse מבשילים את ה Pre-rRNA ומשאירים ממנו 18s, 28s ו5.8s בוגרים שמרכיבים ביחד ריבוזום.
הrRNA יכול לעבור מודיפיקציות (מתילציות, למשל)
מולקולות Small-RNAs שקשורות לגרעינון משועתקות ע"י פול-,2 מביאות חלבונים לrRNA ומבצעות עליו מתילציה.
ע"י כך הן תורמות לתהליך ההבשלה שלו.
*תזכורת: כדי להגיע למצב ההתחלה (initiation) יש צורך בפקטורי שעתוק - TF
RNA-פולימראז-3 - מתיישב על הפרומוטור שלפני הגן שהוא רוצה לשעתק. לשם כך הוא נעזר בTF (פקטור שעתוק, Transcription Factor) - הפקטורים הם TF3A, TF3B.
RNA-פולימראז-3 גם משעתק את rRNA 5s אשר חלק מצבר מולקולות הrRNA בגרעינון.
שעתוק של 5s rRNA
דרוש גם TF3A בזמן שעתוק של 5s כדי שיוכל לזהות את הפרומוטור. TF3A מתיישב על הגן ונמביא אליו את TF3C, ואז TF3B יכול להגיע לגן. רק אז, האנזים יכול להתחיל בשעתוק.
דרך ל"כיבוי" הגן:
כאשר נוצרות הרבה מולקולות של 5s ויש עודף שלהן, הן מתלפפות עם הTF3A והוא מתלפף ונחסם, ואינו מסוגל להתיישב על הפרומוטור - מה שגורם להפסקה של פעילות הגן.
RNA-פולימראז-2 - אצל אאוקריוטים הפרומוטור גדול בהרבה מאשר אצל פרוקריוטים ומורכב יותר, מכיוון שנקשרים אליו יותר פקטורים.
אזור שנקרא GC BOX קיים הרבה אצל גנים מסוג Housekeeping, שמבוטאים בכל הרקמות בגוף ברצף הבקרה שלהם.
אצל גנים ספציפים לרקמה מסויימת (כמו גן שמייצר גלוקוז שנמצא בכבד) מצאו רצפי TATA Box.
כדי שתהליך הinitiation יצא לפועל, הRNA-פולימראז-2 צריך ליצר קודם קומפלקס שמורכב מ GTF - General Translation Factors או BTF - Basal Translation Factors.
הTATA Box ממוקם Upstream (לפני הגן). TF2D הוא הקומפלקס הראשון שמתיישב על הTATA Box ויש בו מספר חלבונים: TBP - TTA Binding Protein, חלבון שנקשר לTATA Box.
גם TATA Binding Associated Factors שהם קבוצה אחרת של חלבונים (אין צורך בפירוט..)
TF2A מתחבר למולקולה ומחזק את הקשר. TF2B מסמן לRNA-פולימראז-2 את המקום בו הוא צריך להתיישב (לפני הגן).
TF2F מגיע ביחד עם RNA-פולימראז-2 ועוזר לו להתחבר (מושך אותו לפרומוטור).
TF2H-הליקאז פותח את הDNA כדי לאפשר לאנזים להתיישב ב"נוח".
לאחר שכל הפקטורים האלו סיימו את תפקידם, האנזים יכול להתחיל לעבוד.
CTD - C Terminus Domain - הקצה הC של האנזים ארוך כמו זנב וזהו אחד החלקים החשובים אצלו. בגלל שהרבה פקטורים יכולים להקשר אל הזנב הזה, רואים שאי אפשר להתחיל בתהליך השעתוק לפני שהCTD עובר זרחון.
TBP - (מסומן כסליל ירוק במצגת) על הTATA Domain ומקפל את הDNA. כתוצאה מהקיפול, אפשר להביא חלבונים אחרים להתיישב על הDNA. הTBP משמש תמיד כ Pre Initiation Complex גם כאשר אין TATA Box ברצף. גנים עם פחות רצפי TATA מבוטאים בצורה נמוכה.
ידוע היום שכ 2/3 מהגנים לא מכילים רצפי TATA Box. יש אתר אחר שנקרא Initiator, ובכל זאת TBP משתתף.
תאי הגוף שלנו נוצרים מתאי אב (Stem Cells). תא אב מתמיין לתא אב יותר מבוגר.
בתא צעיר (Embrionic Cell) שמו לב שאין ביטוי של β-גלובין (גן שמפיק תאי דם), ולעומתו תא דם אדום כן מבטא β-גלובין. בניסוי שנערך ביטאו קטע DNA בכל אחד מהתאים האלו וגילו שהDNA מתא הדם האדום נחתך בקלות רבה יותר מאשר התא הצעיר.
המסקנה הייתה שיש הבדל באריזת הDNA אצל תא צעיר, שעדיין אין שימוש בגנים שלו לעומת תא דם אדום שאצלו קיימת נגישות גבוהה לDNA-פולימראז-2.
DNA בעל רגישות גבוהה יותר מכונה: "DNA Hyper Sensitive Site".
אצל תא כבד, אזור הβ-גלובין דחוס מכיוון שהוא לא עושה שימוש בגן הזה, לעומת תא אדום שאצלו האזור הזה פתוח.
Chromatine Remodelling - הDNA נפתח ונסגר באזורים מסויימים. זהו נושא חדש שנמצא במחקר. יש אוסף שלם של חלבונים "רעבים" לאנרגיה שמושקעת בפתיחה וסגירה של DNA וחלק גדול מהאנרגיה בתא, הATP משמש לכך.
התהליכים האלו נעזרים בהיסטונים. קצוות ההיסטונים בולטים החוצה, ועליהם מתרחשות מודיפיקציות (למשל: אצטילציה, מתילציה, פוספורילציה, יוביקויטינציה ועוד...) בהתאם לחומצה האמינית, והן גורמות לשינויים במטענים שמכווצים או פותחים את הDNA בהתאמה.
אצטילציה על היסטין 3 יכולה להוביל לפתיחת כרומטין. מתילציה לעומת זאת מביאה לסגירה.
DNA Enchancers & Silencers - במרחק של כ100bp מהפרומוטור, יכולים להשפיע על השעתוק.
אם הDNA מתקפל ומגיע לפרומוטור, פעולת Enhancement נשעית ע"י רצף כזה מחלבון שנקרא Activator שמגביר את פעילות הפולימראז וגורם לו לעבוד מהר יותר.
אם יש צורך להשתיק אזור מסויים, התא משתמש באזור של Silencer שנמצא רחוק יחסית מהגן. גן של רפרסור משפיע על קצב פעילות הפולימראז ומכבה אותו.
Co-Activator - קומפלקס של אקטיבטור.
חוקרים גילו כי קיים קשר בין כמויות ההיסטונים השונים - יש כמויות כפולות של ההיסטונים H2,H3,H4 יותר מאשר H1.
אורך כל שרשרת כזו הוא כ100 אנגסטרם.
כאשר לקחו DNA ארוז בנוקליאוזום והוסיפו לו נוקליאז (DNAse שחותך DNA דו-גדילי) מצאו שהוא מסוגל לחתוך רק באזורים שבין הנוקליאוזום, וכך קיבלו DNA שהחלקים שאינם חתוכים בו הם ה"חרוזים" - הנוקליאוזומים. כל גודל של ליפוף (גודל של נוקליאוזום) כזה הוא 200bp.
ע"י הוסיפת DNAse לDNA בהדרגה, וראו שלחתיכות הDNA שנוצרו היה קל יותר לנוע בתוך הג'ל, וגודל הקפיצות הוא כ200bp. הסיקו מכך שמבנה הנוקליאוזום הוא של היסטונים וזהו אורכו.
היקף הDNA מסביב ל"חרוז" הוא 145bp והלינקר-DNA הוא באורך של 55bp.
בניסוי נוסף, הוציאו את ההיסטון H1 מכרומטין. כתוצאה מכך השתבש מבנה הנוקליאוזום, והמסקנה הייתה שH1 חיוני למבנה הקומפקטי והתקין של הנוקליאוזום.
DNA ארוז בכרומוזום ומכווץ פי 10,000 יותר מאשר בצורתו הרפויה.
ביצורים פרוקריוטים אין היסטונים מכיוון שאין להם גרעין.
בתאים אאוקריוטים קיימים 3 סוגי RNA-פולימראז (RNA-פולימראז 1, 2 ו- 3).
RNA-פולימראז-1 נמצא בגרעינון ומסנתז rRNA (רנ"א ריבוזומלי). הוא עובד בעיקר על מולקולות rRNA ויש לו פרומוטור אחד. הריבוזום מתרגם את הRNA לחלבון.
18s היא היחידה הקטנה שמרכיבה את הrRNA
28s היא היחידה הגדולה שמרכיבה את הrRNA. מורכב מ2 תת-יחידות נוספות: 5.8s, 5s
באאורקיוטים יש חזרות של גנים, ובהם יש אזורים שמקודדים לrRNA השונים, בינהם יש אזורים פחות חשובים בDNA.
RNA-פולימראז-1 משעתק ממנו Pre-Ribosomal-RNA - Pre-rRNA - 45s.
אנזימי RNAse מבשילים את ה Pre-rRNA ומשאירים ממנו 18s, 28s ו5.8s בוגרים שמרכיבים ביחד ריבוזום.
הrRNA יכול לעבור מודיפיקציות (מתילציות, למשל)
מולקולות Small-RNAs שקשורות לגרעינון משועתקות ע"י פול-,2 מביאות חלבונים לrRNA ומבצעות עליו מתילציה.
ע"י כך הן תורמות לתהליך ההבשלה שלו.
*תזכורת: כדי להגיע למצב ההתחלה (initiation) יש צורך בפקטורי שעתוק - TF
RNA-פולימראז-3 - מתיישב על הפרומוטור שלפני הגן שהוא רוצה לשעתק. לשם כך הוא נעזר בTF (פקטור שעתוק, Transcription Factor) - הפקטורים הם TF3A, TF3B.
RNA-פולימראז-3 גם משעתק את rRNA 5s אשר חלק מצבר מולקולות הrRNA בגרעינון.
שעתוק של 5s rRNA
דרוש גם TF3A בזמן שעתוק של 5s כדי שיוכל לזהות את הפרומוטור. TF3A מתיישב על הגן ונמביא אליו את TF3C, ואז TF3B יכול להגיע לגן. רק אז, האנזים יכול להתחיל בשעתוק.
דרך ל"כיבוי" הגן:
כאשר נוצרות הרבה מולקולות של 5s ויש עודף שלהן, הן מתלפפות עם הTF3A והוא מתלפף ונחסם, ואינו מסוגל להתיישב על הפרומוטור - מה שגורם להפסקה של פעילות הגן.
RNA-פולימראז-2 - אצל אאוקריוטים הפרומוטור גדול בהרבה מאשר אצל פרוקריוטים ומורכב יותר, מכיוון שנקשרים אליו יותר פקטורים.
אזור שנקרא GC BOX קיים הרבה אצל גנים מסוג Housekeeping, שמבוטאים בכל הרקמות בגוף ברצף הבקרה שלהם.
אצל גנים ספציפים לרקמה מסויימת (כמו גן שמייצר גלוקוז שנמצא בכבד) מצאו רצפי TATA Box.
כדי שתהליך הinitiation יצא לפועל, הRNA-פולימראז-2 צריך ליצר קודם קומפלקס שמורכב מ GTF - General Translation Factors או BTF - Basal Translation Factors.
הTATA Box ממוקם Upstream (לפני הגן). TF2D הוא הקומפלקס הראשון שמתיישב על הTATA Box ויש בו מספר חלבונים: TBP - TTA Binding Protein, חלבון שנקשר לTATA Box.
גם TATA Binding Associated Factors שהם קבוצה אחרת של חלבונים (אין צורך בפירוט..)
TF2A מתחבר למולקולה ומחזק את הקשר. TF2B מסמן לRNA-פולימראז-2 את המקום בו הוא צריך להתיישב (לפני הגן).
TF2F מגיע ביחד עם RNA-פולימראז-2 ועוזר לו להתחבר (מושך אותו לפרומוטור).
TF2H-הליקאז פותח את הDNA כדי לאפשר לאנזים להתיישב ב"נוח".
לאחר שכל הפקטורים האלו סיימו את תפקידם, האנזים יכול להתחיל לעבוד.
CTD - C Terminus Domain - הקצה הC של האנזים ארוך כמו זנב וזהו אחד החלקים החשובים אצלו. בגלל שהרבה פקטורים יכולים להקשר אל הזנב הזה, רואים שאי אפשר להתחיל בתהליך השעתוק לפני שהCTD עובר זרחון.
TBP - (מסומן כסליל ירוק במצגת) על הTATA Domain ומקפל את הDNA. כתוצאה מהקיפול, אפשר להביא חלבונים אחרים להתיישב על הDNA. הTBP משמש תמיד כ Pre Initiation Complex גם כאשר אין TATA Box ברצף. גנים עם פחות רצפי TATA מבוטאים בצורה נמוכה.
ידוע היום שכ 2/3 מהגנים לא מכילים רצפי TATA Box. יש אתר אחר שנקרא Initiator, ובכל זאת TBP משתתף.
תאי הגוף שלנו נוצרים מתאי אב (Stem Cells). תא אב מתמיין לתא אב יותר מבוגר.
בתא צעיר (Embrionic Cell) שמו לב שאין ביטוי של β-גלובין (גן שמפיק תאי דם), ולעומתו תא דם אדום כן מבטא β-גלובין. בניסוי שנערך ביטאו קטע DNA בכל אחד מהתאים האלו וגילו שהDNA מתא הדם האדום נחתך בקלות רבה יותר מאשר התא הצעיר.
המסקנה הייתה שיש הבדל באריזת הDNA אצל תא צעיר, שעדיין אין שימוש בגנים שלו לעומת תא דם אדום שאצלו קיימת נגישות גבוהה לDNA-פולימראז-2.
DNA בעל רגישות גבוהה יותר מכונה: "DNA Hyper Sensitive Site".
אצל תא כבד, אזור הβ-גלובין דחוס מכיוון שהוא לא עושה שימוש בגן הזה, לעומת תא אדום שאצלו האזור הזה פתוח.
Chromatine Remodelling - הDNA נפתח ונסגר באזורים מסויימים. זהו נושא חדש שנמצא במחקר. יש אוסף שלם של חלבונים "רעבים" לאנרגיה שמושקעת בפתיחה וסגירה של DNA וחלק גדול מהאנרגיה בתא, הATP משמש לכך.
התהליכים האלו נעזרים בהיסטונים. קצוות ההיסטונים בולטים החוצה, ועליהם מתרחשות מודיפיקציות (למשל: אצטילציה, מתילציה, פוספורילציה, יוביקויטינציה ועוד...) בהתאם לחומצה האמינית, והן גורמות לשינויים במטענים שמכווצים או פותחים את הDNA בהתאמה.
אצטילציה על היסטין 3 יכולה להוביל לפתיחת כרומטין. מתילציה לעומת זאת מביאה לסגירה.
DNA Enchancers & Silencers - במרחק של כ100bp מהפרומוטור, יכולים להשפיע על השעתוק.
אם הDNA מתקפל ומגיע לפרומוטור, פעולת Enhancement נשעית ע"י רצף כזה מחלבון שנקרא Activator שמגביר את פעילות הפולימראז וגורם לו לעבוד מהר יותר.
אם יש צורך להשתיק אזור מסויים, התא משתמש באזור של Silencer שנמצא רחוק יחסית מהגן. גן של רפרסור משפיע על קצב פעילות הפולימראז ומכבה אותו.
Co-Activator - קומפלקס של אקטיבטור.
אין תגובות:
הוסף רשומת תגובה