ביוכימיה – הרצאה (30.3.08)

שיעור #18

K_cat – The turnover number

חלק 1: משמעות הקינטיקה האנזימטית

חלק 2: סוגים שונים של מעכבים

K_cat הוא מדד לפעילות הקטליטית של האנזים, והוא גם מודד את הסיבובים (או מס' המחזורים של האנזים). במילים אחרות, זהו מס' מולקולות הסובסטרט שנהפכות על ידי האנזים לתוצר ליחידת זמן.

ככל שהK_cat גבוה יותר, האנזים פעיל יותר, והוא נמדד כ Sec/-1.

K_cat יכול להיות 1, 0.5 או אפילו מיליונים לשניה.

הK2 מוגדר כשלב המגביל. לכל שלב שנוסף יש K משלו, ולרוב יש כנראה לפחות שלב אחת שמגביל את התגובה (צוואר בקבוק).

הK_cat הוא מדד לכל השלבים שאם לא עוברים אותם (והם מעכבים את התפתחות התגובה) התגובה לא תתרחש, או שהיא תתרחש באיטיות רבה.

כשבודקים קינטיקה צריך רק לבדוק את ערכו של Kcat.

K_cat במקרה של מיכאליס-מנטן הוא K2.

1. K_cat הוא מדד לכושר הקטליטי של האנזים.

2. מס' המולקולות במולים של הסובסטרט שעוברות שינוי למול של אנזים לשניה.

3. - מס' המחזוריםturnover-number. המס' יכול לנוע מ40 מיליון פעולות לשניה (עבור קטלאז) ועד ל0.5 פעולות לשניה (עבור ליזוזום).

אפשר להשתמש ביחס בין K_cat לkm כדי להגדיר את יעילות האנזים.

אם הk_cat נמוך מאוד, יקח הרבה זמן להפוך את הסובסטראט לתוצר. לכן, אפשר להשוות בין אנזימים שונים לפי היחס בין K_cat ל Km שמהווה את היעילות הקטליטית.

לכל אנזים יש Km וk_cat מסויים עבור פעילות קטליטית כלשהי. ככל שהיחס גדול יותר, האנזים יעיל יותר ונותן יותר תוצרים עבור אותה יחידת זמן.

גרף של V כפונקציה של ריכוז הסובסטראט עבור שני אנזימים: אם מכפילים את ריכוז האנזים פי 2, גם מהירות הריאקציה תגדל פי 2.

יש אנזימים שצריכים 2 סובסטראטים כדי לפעול. הפעילות שלהם נקראת Random כי הם מסוגלים לקשור סובסטראט א' או ב'. הקשירה מתבצעת בצורה אקראית. יש גם פעילות קישור מסודרת – עד שאנזים לא קושר סובסטראט א', הוא לא יוכל לקשור את סובסטראט ב'.

פעילות פינג-פונג

זוהי פעילות שבה יש כמה מצבים שבהם האנזים יכול להמצא. מצב ברירת המחדל הוא הE. תוך כדי שהאנזים קושר את הסובסטראט, חלק מS1 הופך לP1. P1 משתחרר, אבל שארית מS1 עדיין קשורה לאנזים והוא נמצא במצב ביניים שנקרא E'. הסובסטראט השני נקשר, התגובה האנזימטית מתבצעת וS2 הופך לP2. בסוף התהליך האנזים נשאר E (לא עובר שינוי אבל במצב הביניים, באמצע התגובה, האנזים הופך לE' כי הוא קשר משהו.

כימוטריפסין עובד לפי מנגנון פינג-פונג: האנזים מנתק את הקשר הפפטידי באתר הפעיל, והחלק הN-טרמינלי עדיין קשור לאנזים. כדי לשחרר את החלק הקשור צריך מים. מים הם הסובסטראט השני שמסוגל לשחרר את השרשרת.

מעכבים

חומרים שמעכבים פעילות אנזימטית – מתחלקים ל2 קבוצות.

1) מעכבים הפיכים

2) מעכבים בלתי הפיכים

למעכבים הפיכים יש לרוב קישור לא קוולנטי של הקישור לאנזים. במצב של מעכב בלתי הפיך יש לרוב קישור קוולנטי של המעכב לאנזים.

מעכבים בלתי הפיכים הם הרבה פעמים רעלנים שמשבשים את פעילות האנזים.

מעכבים הפיכים

מסוגלים לעכב את הפעילות האנזימטית, אבל כאשר מסלקים את המעכב, מחזירים את הפעילות האנזימטית לקודמה.

אפשר להפריד מעכב הפיך מאנזים בעזרת דיאליזה – המעכב יעבור דילול והאנזים לא יעבור דיפוזיה (הוא ישאר בשקית). כשהמעכב מסולק מהתמיסה, האנזים ימשיך לפעול כרגיל.

Ki – קבוע העיכוב.

ישנן 2 קבוצות עיקריות של מעכבים (כולם הפיכים), וקבוצה שלישית תיאורטית:

1. מעכב תחרותי

2. מעכב לא תחרותי

3. מעכב בלתי-תחרותי – לרוב מקרה שלא קיים באמת.

מעכב תחרותי נקשר לאתר הפעיל של האנזים כי הוא דומה לסובסטראט. יש לו אפיניות גבוהה לאתר הפעיל ביחס לסובסטראט.

האנזים יכול להקשר או לסובסטראט או למעכב. אם נוצר קומפלקס EI, לא קורה כלום. ככל שמגדילים את ריכוז הסובסטראט, המעכב ישפיע פחות, כי יש יותר סובסטראט מאשר מעכב, ויש יותר סיכוי שאנזים יקשר לסובסטראט.

המעכב מפריע לפעילות הקטליטית (לא נותן לסובסטראט להפוך לתוצר) לכן צריך יותר סובסטראט כדי לקבל את אותה כמות תוצרים (או אותה מהירות), לכן צריך להעלות את הkm.

כאשר משווים בין שני גרפים – אחד עם מעכב והשני בלי מעכב, שניהם יגיעו בסופו של דבר לאותו Vmax, אבל במקרה שיש מעכב נוסיף יותר סובסטראט כדי להגיע לvmax.

מעכב לא-תחרותי

זהו מעכב שלא נקשר לאותו אתר פעיל כמו הסובסטראט (הוא נקשר באתר אחר על גבי האנזים).

מעכב לא תחרותי פוגע בפעילות האנזים (לא פוגע בקישור לסובסטראט).

האפיניות של האנזים לסובסטראט לא משתנה כתוצאה מהקישור של האנזים למעכב, ולכן Km נשאר קבוע. Vmax הוא זה שיורד.

בסופו של דבר המעכב מוריד את יעילות האנזים. הkm לא משתנה.

סוג נוסף של מעכבים הפיכים (לא נדבר על המשוואות שלהם) הוא מעכב מעורב – Mixed Inhibitor. אותו מעכב מסוגל להשפיע על Vmax וגם על Km.

אף אחד מהחיתוכים של הגרפים לא נשאר קבוע.

אפשר להשתמש במעכבים כתרופה – לדוגמא ריטונביר – ritonavir. זו תרופה שמבוססת על פפטיד, שדומה לאזור הפפטידי שהפרוטיאז שוירוס הHIV מזהה, והוא הכרחי לקיפול של הוירוס ולפעילות של הוירוס.

סונתז מעכב שדומה לאתר שמזוהה על ידי הפרוטיאז. בחלק מהזמן, האנזים של הוירוס נקשר למעכב במקום לתאים.

מעכבים בלתי-הפיכים

יש בהתחלה שיווי משקל בין המעכב לאנזים. בשלב כלשהו, המעכב תוקף את האנזים וגורם לאינאקטיבציה של האנזים על ידי קשירה קוולנטית באחד האתרים שלו (לא בהכרח באתר הפעיל). אין אפשרות להחזיר את הפעילות האנזימטית לקדמותה לאחר שהמעכב מסולק.

המעכב יכול להקשר לאנזים גם כאשר קשור לו סובסטראט. שלב זה יכול להיות הפיך, אבל אחרי זמן מסויים המעכב תוקף את האנזים, ונקשר קוולנטית.

לקבוע התגובה קוראים Kinact.

בסוף נקבל קומפלקס אנזים-מעכב הקשורים בקשר קוולנטי שלא ניתן להפריד בינהם. משוואות התהליך מסובכות מאוד.

פנאצילין הוא בלתי הפיך – הוא מעכב אנזימים שמעורבים בסינתזה של דופן החיידק.