שיעור #6
קיימים 3 הבדלים עיקריים בין הכפלה לשעתוק:
בRNA לעומת זאת, יחס הטעויות הוא כ 1:10,000.
mRNA - רנ"א שליח, או Messenger-RNA, הוא החלק שמקודד לחלבון ומהווה כ5% מהRNA בתא.
הtRNA אחראי להביא חומצות אמינו מתאימות בכל פעם לRNA.
rRNA - רנ"א ריבוזומלי מהווה חלק גדול מאחוז הRNA בתא.
Small RNAs - מולקולות RNA קטנטנות שמבקרות את פעולות הRNA בתא.
תהליך השעתוק מתחלק ל3 חלקים:
בשנות השישים גילו לראשונה את מולקולת הRNA. מאוחר יותר גילו את מולקולות הריבוזומים ואת הmRNA.
גלקטוז וגלוקוז הם שני חומרים שהחיידק יודע לפרק ולנצל עבור אנרגיה. את הלקטוז החיידק מפרק בעזרת האנזים
β-גלקטוסידאז (קיימים עוד 2 אנזימים שמופרשים). האנזים הזה אינו מיוצר בכמויות גדולות אצל החיידק גם כאשר יש לו שפע של גלוקוז, אך כאשר יש לחיידק הרבה לקטוז, יש ייצור המוני של האנזים. מכאן הסיקו חוקרים, שהחיידק מגיב לשינויים סביבתיים ולפיכך יכול לשפעל או לכבות גן בהתאמה.
קיימת בקרה (או סיגנל) שגורם למולקולה מתווכת להעביר את הסיגנל הזה. המולקולה הזו מופיעה כשיש צורך ונעלמת כאשר אין יותר צורך בתהליך.
בניסוי שנערך נבדקו מס' מקרים בהם החיידקים מגיבים לסביבה:
כאשר יש mRNA שצריך לקודד לחלבון, מולקולת הרפרסור גורמת לכך. אזור הקשירה של הרפרסור לDNA נקרא אופרטור (Operator).
לחיידקים יש אופרון (Operon) - יחידה בגנים שבה יש מספר גנים אחד ליד השני ברצף מיד לאחר רצף האופרטור.
בשלב הInitiation, הרפרסור יוצר mRNA שמקודד לחלבון רפרסור שמסוגל להצמד לאופרטור, וכך עוצר את
הRNA-פולימראז מלהצמד אליו ולסנתז אנזימים או חלבונים. כאשר הלקטוז נכנס למערכת, הוא נקשר לרפרסור ומשנה את המבנה שלו, ואז האופרטור חשוף לפעילות RNA-פולימראז, ואנזימים יכולים להיות מסונתזים ברצף האופרון.
בניסוי שבו התגלה הmRNA, הודבקו חיידקים בבקטריופאג' מסוג T2 השולט על החיידק, והוא החל לייצר RNA וחלבונים משל עצמו.
בשיטת Pulse Labelling (שיטה לזיהוי נוכחות מולקולות, בעיקר רנ"א שליח) השתמשו באיזוטופ P32, המסמן מולקולות DNA שהוכנסו לתאים. לאחר זמן מה הוציאו את החומר וראו כמה מולקולת רדיואקטיביות הוכנסו לתאים.
בניסוי עם RNA בחיידקים מדדו את כמות ה RNA שקיימת בתא, ומצאו שיש בעיקר 23s ו- 16s, שהן מולקולות RNA ריבוזומלי.
כשביצאו את הניסוי עם S ראדיואקטיבי ומדדו CPM, מצאו הרבה מולקולות RNA כתוצאה מהדבקת הבאקטריופאג'.
(CPM = Counts Per Minute) מולקולות אלו היו mRNA. מאוחר יותר התגלה שהן נוצרו ע"י הוירוס.
הגדיל הנגדי, המקודד, נקרא Sense (Coding) Strand.
הגדיל השני נקרא Anti-Sense (noncoding) Strand.
בחיידקים יש רק סוג אחד של האנזים הזה - RNAP, (או RNA-פולימראז-1).
ביצורים אאוקריוטים יש RNA-פולימראז-1, 2 ו3 שמייצרים rRNA, mRNA, ו-small RNAs.
ריפמיצין הוא חומר שמפסיק שעתוק של RNA אצל חיידקים ע"י עיכוב תת יחידה בטא של RNA-פולימראז. הוא לא עובד על RNA-פולימראז אצל יצורים אאוקריוטים.
אלפא-אמניטין הוא חומר שמעכב RNA-פולימראז אצל יצורים אאוקריוטים (בני אדם..). ברמות שונות, החומר יכול לעכב RNA-פולימראז שונים.
Cordycepin - חומר שגורם להפסקה של שעתוק בתאים. הוא דונה לאדנוזין (A), אך במקום 3'-OH, יש לו H ולכן הוא גורם לטרמינציה בשעתוק.
אקטינומיצין D - חומר שמעכב שעתוק (חזק מאוד). הוא נכנס לDNA ומתחבר אליו וסותם את ה minor groove.
ע"י כך הוא חוסם א הRNA-פולימראז ולא מאפשר לו לשעתק.
ההכפלה נעשית מהר, אך במעט מקומות בתא מכיוון שכמות הDNA-פולימראז-3 קטנה (כ10 מולקולות בתא בלבד).
קצב ההכפלה הוא כ 500-1000 נוקליאוטידים לשניה.
קיימות 3000 מולקולות RNA-פולימראז בתא, אך קצב העבודה שלהן איטי יותר - כ50 נוקליאוטידים לשניה.
RNA-פולימראז בפרוקריוטים
המולקולה העיקרית שמבצעת את תהליך השעתוק מורכבת מ2 תת-יחידות - אלפא ובתא (α, β). חלק זה נקרא Core-Polimerase. פקטורים נוספים יכולים להקשר אליו, כמו פקטור סיגמא.
פקטור סיגמא (σ) מקנה לאנזים את היכולת למצוא מקום ממנו הוא יוכל להתחיל לשעתק.
תהליך ה Scanning הוא בדיקת הDNA כדי למצוא פרומוטור, רצף בקרה שמצוי לפני כל תחילת גן. הפולימראז מתיישב על הפרומוטור, נצמד אליו כקומפלקס סגור ומתחיל לפרום את שני הגדילים. 8-9 בסיסים אחרי שהתהליך התחיל, עוזב פקטור סיגמא את הפולימראז, וזה ממשיך לעבוד עד סיום שעתוק הגן הרצוי, שם הוא עוצר.
מושגים
Upstream - האזור שמצוי לפני הגן עצמו.
Downstream - האזור שמצוי אחרי הגן. הנוקליאוטיד שממנו מתחיל התרגום הוא 1+.
Unwinding - פתיחת הDNA. האזור הפתוח הוא באורך של כ180 bp.
אצל חיידקים הנוקליאוטיד הראשון 1+ הוא בד"כ פורין (A או G).
UTR - אזור לא מתורגם (Untranslated Region). יכול להיות גם אזור בקרה.
Abortive Initiation - לפעמים הRNA-פולימראז מייצר מס' קטן של בסיסים, אבל מסיבה כלשהי התהליך לא עובד, והוא מפסיק, חוזר למקום ההתחלתי ומתחיל שוב את התהליך.
Active Site - האזור הפעיל באנזים בו מתרחשת תגובה ביוכימית. בRNA-פולימראז יש 2 יונים של MG+2 מהאתר הפעיל.
טופואיזומראז-1 - אנזים שמשחרר לחץ מאחורה.
טופואיזומראז-2 (נקרא גם גיראז, Girase) - משחרר לחץ מקדימה.
RNA-פולימראז משתהה לפעמים ומסוגל לחזור אחורה (Backtracking). כאשר הוא עושה זאת, גם פתיחת הDNA צריכה לחזור כמה שלבים אחורה. עדייו לא ברור מדוע זה קורה.
הפולימראז יכול לעשות "סליידינג" (Sliding) - להתעלם מהזנב שכבר נוצר ולהמשיך ליצור שוב.
יש אנזימים שחותכים את הזנב הקטן, ואז הוא מתחיל לשעתק שוב מההתחלה.
בrRNA יש חזרה של ייצור של יותר מRNA אחד בו זמנית.
בmRNA יש ייצור בודד (כאשר צריך).
Housekeeping Genes - גנים שמשועתקים בקצב קבוע, ללא קשר או תלות בגורמים חיצוניים והסביבה.
Inducible Genes - גנים שמשועתקים רק בשעת הצורך.
Concencus Sequence - רצף שכמעט תמיד מכיל את אותו רצף הפרומוטור. כאשר בחנו את האזורים הללו, מצאו אזורים דומים שפקטור סיגמא יכול לזהות.
בתהליך הטרמינציה (Termination) יש שני חלקים:
- הRNA מורכב ומיוצר כגדיל אחד, לעומת הDNA שנמצא במצב דו-גדילי.
- בהכפלה יש צורך להכפיל את כל הגנים, ואילו בתהליך השעתוק רק חלק מסויים.
- בהכפלה יש צורך בדיוק מירבי, מכיוון שהחומר הגנטי המוכפל עובר לתאים חדשים.
בRNA לעומת זאת, יחס הטעויות הוא כ 1:10,000.
mRNA - רנ"א שליח, או Messenger-RNA, הוא החלק שמקודד לחלבון ומהווה כ5% מהRNA בתא.
הtRNA אחראי להביא חומצות אמינו מתאימות בכל פעם לRNA.
rRNA - רנ"א ריבוזומלי מהווה חלק גדול מאחוז הRNA בתא.
Small RNAs - מולקולות RNA קטנטנות שמבקרות את פעולות הRNA בתא.
תהליך השעתוק מתחלק ל3 חלקים:
- תחילת השעתוק (Initiation) - הRNA-פולימראז "מתיישב" על הגן הספציפי שאותו הוא משעתק.
- ההכפלה, או ההארכה (Elongation) - התהליך עצמו בו הDNA מתארך.
- סיום, טרמינציה (Termination) - סוף התהליך, בו השעתוק מסתיים (כיצד "יודע" הRNA מתי ואיך לעצור?)
בשנות השישים גילו לראשונה את מולקולת הRNA. מאוחר יותר גילו את מולקולות הריבוזומים ואת הmRNA.
גלקטוז וגלוקוז הם שני חומרים שהחיידק יודע לפרק ולנצל עבור אנרגיה. את הלקטוז החיידק מפרק בעזרת האנזים
β-גלקטוסידאז (קיימים עוד 2 אנזימים שמופרשים). האנזים הזה אינו מיוצר בכמויות גדולות אצל החיידק גם כאשר יש לו שפע של גלוקוז, אך כאשר יש לחיידק הרבה לקטוז, יש ייצור המוני של האנזים. מכאן הסיקו חוקרים, שהחיידק מגיב לשינויים סביבתיים ולפיכך יכול לשפעל או לכבות גן בהתאמה.
קיימת בקרה (או סיגנל) שגורם למולקולה מתווכת להעביר את הסיגנל הזה. המולקולה הזו מופיעה כשיש צורך ונעלמת כאשר אין יותר צורך בתהליך.
בניסוי שנערך נבדקו מס' מקרים בהם החיידקים מגיבים לסביבה:
- מוטנט שגדל במצע ללא גלוקוז גורם לביטוי הקבוע של האנזימים המופרשים ללא קשר למצע עליו גדל החיידק.
- חיידקים, שכאשר מוסיפים להם למצע לקטוז אינם מייצרים את האנזימים. (Non-Inducible)
כאשר יש mRNA שצריך לקודד לחלבון, מולקולת הרפרסור גורמת לכך. אזור הקשירה של הרפרסור לDNA נקרא אופרטור (Operator).
לחיידקים יש אופרון (Operon) - יחידה בגנים שבה יש מספר גנים אחד ליד השני ברצף מיד לאחר רצף האופרטור.
בשלב הInitiation, הרפרסור יוצר mRNA שמקודד לחלבון רפרסור שמסוגל להצמד לאופרטור, וכך עוצר את
הRNA-פולימראז מלהצמד אליו ולסנתז אנזימים או חלבונים. כאשר הלקטוז נכנס למערכת, הוא נקשר לרפרסור ומשנה את המבנה שלו, ואז האופרטור חשוף לפעילות RNA-פולימראז, ואנזימים יכולים להיות מסונתזים ברצף האופרון.
בניסוי שבו התגלה הmRNA, הודבקו חיידקים בבקטריופאג' מסוג T2 השולט על החיידק, והוא החל לייצר RNA וחלבונים משל עצמו.
בשיטת Pulse Labelling (שיטה לזיהוי נוכחות מולקולות, בעיקר רנ"א שליח) השתמשו באיזוטופ P32, המסמן מולקולות DNA שהוכנסו לתאים. לאחר זמן מה הוציאו את החומר וראו כמה מולקולת רדיואקטיביות הוכנסו לתאים.
בניסוי עם RNA בחיידקים מדדו את כמות ה RNA שקיימת בתא, ומצאו שיש בעיקר 23s ו- 16s, שהן מולקולות RNA ריבוזומלי.
כשביצאו את הניסוי עם S ראדיואקטיבי ומדדו CPM, מצאו הרבה מולקולות RNA כתוצאה מהדבקת הבאקטריופאג'.
(CPM = Counts Per Minute) מולקולות אלו היו mRNA. מאוחר יותר התגלה שהן נוצרו ע"י הוירוס.
RNA-פולימראז
האנזים RNA-פולימראז יושב על הDNA, מפריד את שני הסלילים ומוסיך נוקליאוטידים טרי-פוספטים. הוא עובד בכיווניות 5' ל3'. אין צורך בפריימר - הוא מתחיל לעבוד מיד אחרי שהוא מתיישב על הDNA.הגדיל הנגדי, המקודד, נקרא Sense (Coding) Strand.
הגדיל השני נקרא Anti-Sense (noncoding) Strand.
בחיידקים יש רק סוג אחד של האנזים הזה - RNAP, (או RNA-פולימראז-1).
ביצורים אאוקריוטים יש RNA-פולימראז-1, 2 ו3 שמייצרים rRNA, mRNA, ו-small RNAs.
ריפמיצין הוא חומר שמפסיק שעתוק של RNA אצל חיידקים ע"י עיכוב תת יחידה בטא של RNA-פולימראז. הוא לא עובד על RNA-פולימראז אצל יצורים אאוקריוטים.
אלפא-אמניטין הוא חומר שמעכב RNA-פולימראז אצל יצורים אאוקריוטים (בני אדם..). ברמות שונות, החומר יכול לעכב RNA-פולימראז שונים.
Cordycepin - חומר שגורם להפסקה של שעתוק בתאים. הוא דונה לאדנוזין (A), אך במקום 3'-OH, יש לו H ולכן הוא גורם לטרמינציה בשעתוק.
אקטינומיצין D - חומר שמעכב שעתוק (חזק מאוד). הוא נכנס לDNA ומתחבר אליו וסותם את ה minor groove.
ע"י כך הוא חוסם א הRNA-פולימראז ולא מאפשר לו לשעתק.
ההכפלה נעשית מהר, אך במעט מקומות בתא מכיוון שכמות הDNA-פולימראז-3 קטנה (כ10 מולקולות בתא בלבד).
קצב ההכפלה הוא כ 500-1000 נוקליאוטידים לשניה.
קיימות 3000 מולקולות RNA-פולימראז בתא, אך קצב העבודה שלהן איטי יותר - כ50 נוקליאוטידים לשניה.
RNA-פולימראז בפרוקריוטים
המולקולה העיקרית שמבצעת את תהליך השעתוק מורכבת מ2 תת-יחידות - אלפא ובתא (α, β). חלק זה נקרא Core-Polimerase. פקטורים נוספים יכולים להקשר אליו, כמו פקטור סיגמא.
פקטור סיגמא (σ) מקנה לאנזים את היכולת למצוא מקום ממנו הוא יוכל להתחיל לשעתק.
תהליך ה Scanning הוא בדיקת הDNA כדי למצוא פרומוטור, רצף בקרה שמצוי לפני כל תחילת גן. הפולימראז מתיישב על הפרומוטור, נצמד אליו כקומפלקס סגור ומתחיל לפרום את שני הגדילים. 8-9 בסיסים אחרי שהתהליך התחיל, עוזב פקטור סיגמא את הפולימראז, וזה ממשיך לעבוד עד סיום שעתוק הגן הרצוי, שם הוא עוצר.
מושגים
Upstream - האזור שמצוי לפני הגן עצמו.
Downstream - האזור שמצוי אחרי הגן. הנוקליאוטיד שממנו מתחיל התרגום הוא 1+.
Unwinding - פתיחת הDNA. האזור הפתוח הוא באורך של כ180 bp.
אצל חיידקים הנוקליאוטיד הראשון 1+ הוא בד"כ פורין (A או G).
UTR - אזור לא מתורגם (Untranslated Region). יכול להיות גם אזור בקרה.
Abortive Initiation - לפעמים הRNA-פולימראז מייצר מס' קטן של בסיסים, אבל מסיבה כלשהי התהליך לא עובד, והוא מפסיק, חוזר למקום ההתחלתי ומתחיל שוב את התהליך.
Active Site - האזור הפעיל באנזים בו מתרחשת תגובה ביוכימית. בRNA-פולימראז יש 2 יונים של MG+2 מהאתר הפעיל.
טופואיזומראז-1 - אנזים שמשחרר לחץ מאחורה.
טופואיזומראז-2 (נקרא גם גיראז, Girase) - משחרר לחץ מקדימה.
RNA-פולימראז משתהה לפעמים ומסוגל לחזור אחורה (Backtracking). כאשר הוא עושה זאת, גם פתיחת הDNA צריכה לחזור כמה שלבים אחורה. עדייו לא ברור מדוע זה קורה.
הפולימראז יכול לעשות "סליידינג" (Sliding) - להתעלם מהזנב שכבר נוצר ולהמשיך ליצור שוב.
יש אנזימים שחותכים את הזנב הקטן, ואז הוא מתחיל לשעתק שוב מההתחלה.
בrRNA יש חזרה של ייצור של יותר מRNA אחד בו זמנית.
בmRNA יש ייצור בודד (כאשר צריך).
Housekeeping Genes - גנים שמשועתקים בקצב קבוע, ללא קשר או תלות בגורמים חיצוניים והסביבה.
Inducible Genes - גנים שמשועתקים רק בשעת הצורך.
Concencus Sequence - רצף שכמעט תמיד מכיל את אותו רצף הפרומוטור. כאשר בחנו את האזורים הללו, מצאו אזורים דומים שפקטור סיגמא יכול לזהות.
בתהליך הטרמינציה (Termination) יש שני חלקים:
- מבנה שניוני של RNA, Stemp Loop, גורם לפולימראז להשתנות. הRNA פולימראז אז יוצא ממקומו.
- פקטור רהו (Ρ) - מולקולה שיוצרת טבעת, מתלבשת על הRNA ומחילקה עליו, מגיעה עד האזור שבו הפולימראז מחובר לRNA. היא פורמת את הקשר DNA-RNA, הם נפרדים והRNA-פולימראז נופל. תהליך זה מתרחש גם, ככל הנראה, באזורים שבהם האנזים משתהה.
אין תגובות:
הוסף רשומת תגובה