ביוכימיה - הרצאה (24.2.08)

שיעור #9

לא ידוע אם יש הליקאז לפני RNA-פולימראז-3. לפני RNA-פולימראז-2 קיים הליקאז.
מלבד הפקטורים הבסיסיים (Basal Factors) בכל פתיחה של גן עבוד RNA-פולימראז-2, יש כאלו ספציפיים לרצף מסויים באזור הפרומוטור. בנוסף ל TATA Box, לגן כלשהו יהיה פקטור מסויים. הפקטור הזה מגביר את התדירות שהפרומוטור שולח לפולימראז, כך שהוא יוציא mRNA בתדירות גבוהה יותר.

פקטורי השעתוק האלו קשורים לאקטיבטורים ולרפרסורים (כולם קשורים זה לזה בצורה כלשהי) ולPre Initiation Complex.
פקטור שעתוק מכיל אזור שקושר DNA - זהו אזור חלבוני שנקשר לMajor Groove ונצמד אליו ע"י כך שהו מזהה רצף פנימי בתוכו. הוא נקשר כדימר (זוג חלבונים) לDNA. אזור זה בפקטור השעתוק נקרא DNA Binding Domain.
החלק השני, הActivation Domain, אינו קושר DNA, אבל קושר חלבונים אחרים - פקטורי שעתוק אחרים או אקטיבטורים. הקשרים האלו יוצרים את הפעילות האקטיבית של הפרומוטור.
שני פקטורים יכולים להשפיע ביחד ברמה של מכפלת היעילות של שניהם (אם אחד מגדיל את היעילות פי 5, והשני מגדיל את היעילות פי 10, אז שניהם ביחד מגדילים את היעילות פי 50).

הגן ציקלין-D1 קשור למחזור התא; הבקרה על הביטוי שלו מאוד ייחודית. פקטורים מסויימים יכולים לגרום לייצור עודף שלו, ואחרים יכולים לגרום למוטציות שמבטלות אותו או גורמות לבעיות.

אופן הקשירה לDNA
קיים מבנה ספציפי יודע לקשור את החלבון.
בחלבון יש אזור שנקרא Zinc Finger שיודע לקשור את הDNA.
חלבון מסוג כזה הוא TF3A. ע"י הכנסת יון אבץ לתוך סליל של חומצת אמינו, נוצרת מעין לולאה בצורת אצבע (שמורכבת מHis ו Cys). האצבע נכנסת לMajor Groove בDNA ונקשרת אליו. זהו למעשה הDNA Binding Domain.
לחלבון אחד יכולות להיות כמה אצבעות שנקשרות לDNA במקומות שונים. השיירים שנמצאים על האצבע הם אלו שמבצעים את פעולת הקשירה.

Helix-Turn-Helix - זהו מבנה בחלבון שיכול להקשר לDNA. שני סלילי-אלפא (α helices) המופרדים ע"י רצף קצר של חומצות אמינו.
Helix-Loop-Helix - מבנה שמופיע בד"כ כדימר - שני "מקלות" שנקשרים לDNA משני הצדדים.
Leucine-Zipper - (לאוצין היא חומצת אמינו) - שני "מקלות" הצמודים זה לזה ע"י "ריצ'ראצ'" של לוצינין אחד ליד השני. כל חומצת אמינו שביעית ברצף, בערך, היא לוצין.

Elongation

RNA-פולימראז-2 לפעמים מנסה לשעתק ולא מצליח, ומתחיל שוב את התהליך מההתחלה.
ח. האמינו סרין יכולה לעבור פוספורילציה (יש רק עוד 2 ח. אמינו נוספות שיכולות לעבור פוספורילציה מלבד סרין).
RNA-פולימראז-2 צריך לעבור בקרה כדי לעבור מתהליך הInitiation לElongation, והוא Hypo-phosphoralization. הסרין אצלו, שממוקם בזנב, צריך לעבור זרחון. הפולימראז לא יכול להתחיל להאריך את השרשרת לפני שפקטור נוסף מזרחן את סרין 2. אחרי שסרין 5 וגם 2 מזורחנות, יצירת הmRNA יכולה להתחיל.
הRNA איננו מזורחן כאשר הוא מגיע לפרומוטור.
RNA-פולימראז-2 הראשון שמגיע נקרא Pioneer (חלוץ). אחריו יגיעו פולימראזות אחרים כאשר להם יש כבר Pre-Initiation-Complex מוכן. בסוף הגן, הRNA-פול-2 צריך סימן שיגרום לו לעצור.
mRNA שנוצר עובר עיבוד בקצה 3'של הסיגנל AAUAAA. אחריו יש מרווח של 10-30 נוקליאוטידים ואז רצף של 2 נוק': CA, אח"כ 30 נוקליאוטידים נוספים ואז רצף עשיר ב G או GU.
אנזים שחותך חלק מסויים בשרשרת, מותיר את הmRNA שמתחיל ברצף AAUAAA חשוף. כדי להגל עליו, נוספים לו 250 נוקליאוטידים מסוג A. רצף זה נקרא Poly-A-Tail או זנב פולי-A. על הזנב הזה יושבים החלבונים CstF ו CPSF. כשמגיע הרצף "AAUAAA" זהו סימן שהפולימראז הגיע לקצה הגן, ושני החלבונים האלו מתנתקים מהפולימראז ומתחברים לשרשרת הRNA בקצה ה3' שהופקה ממנו במקום.

כ 15-25 נוקליאוטידים אחרי ה AAUAAA יש חיתוך של ה RNA, והפולימראז נופל מהגן. החיתוך נעשה ע"י CPSF וCSTF.
ה Poly-A-Tail מוסיף את הרצף של 250 נוקליאוטידים מסוג "A" ואח"כ משתחרר. הוא קשור למספר גדול של חלבונים אותם הוא מצפה. חלבון הPABP - Poly-A Binding Protein הוא שנקשר לזנב הPoly-A ומצפה אותו בקצה 3': כך הוא לא יכול להאכל ע"י נוקליאזות. כל mRNA חייב להיות מוגן על-ידיו בקצה 3' שלו.
גם קצה 5' צריך להיות מוגן, וזה נעשה ע"י קבוצה של חלבונים המבצעים mRNA-Capping. הכיפה הזו, הCap, היא נוקליאוטיד ששמו 7-מתיל-גואנזין (m7G), והוא מחובר לmRNA ע"י גשר של 3 פוספטים, שבקצה ה5' שלו הm7G יושב, וכך השרשרת לא יכולה להתארך יותר. הוא מגן על הRNA מפני האקסונוקליאזות שיכולות לבצע Decapping.
הCap גם עוזר לכוון את הריבוזום אל הmRNA.
כל התהליכים האלו מתרחשים במקביל (Splicing, Capping, PolyA וכו').

Splicing

ביצורים אאוקריוטים קיים תהליך הSplicing הייחודי, שבו נחתכים רצפי אאינטרונים, והאקסונים מודבקים זה לזה (האקסונים מהווים את הרצפים המקודדים בגנום) ויוצרים mRNA בוגר. האינטרונים הם רצף אינו מקודד.
יש חלבונים שמזהים את החיבור בין האינטרונים לאקסונים. החיתוך בינהם נוצר במבנה של לולאה. חלבונים נוספים חותכים בקצה 3', וחלבונים אחרים מדביקים את האקסונים מחדש אחד לשני לפי הסדר.

אזור קונצנזוס - האקסונים הם בד"כ חלקים קטנים יותר מהאינטרונים, וניתן לנבא בערך איך יראה הmRNA לאחר הספלייסינג. חלבונים שנקראים ספלייסוזומים, המורכבים בעיקר מsnRNPs - מולקולות של חלבונים וRNA קטן, הם בעיקר אלו שמבצעים את התהליך. הספלייסוזום מורכב בעיקר מu1, u2, u3, u4, u5, u6:
u1 מתלבש בתחילת הרצף. u2 מתלבש על הBranch Point.
חלבוני הu יכולים לזהות אזורים מסויימים לפי רצף הRNA שלהם, שמתחבר לקצה ה5' של האינטרון. u1 יכול לעזוב, וu6 מתחבר במקומו - זהו מבנה דינמי.

Alternative Splicing

מנגנון הAlternative Splicing מאפשר לקבל מאותו גן צורות שונות של RNA. בתא מוח למשל, יתקבל מבנה כלשהו של RNA, ובתא כיליה יתקבל מבנה שונה.
בשני שרירים שונים גם יכולים להתקבל מבנים שונים של mRNA כתוצאה מספלייסינג שונה קצת שמותאם לסוג התא.

mRNA Editing

מצאו שיש תהליכי עריכה במקומות מסויימים- מודיפיקציה מסויימת על נוקליאוטיד בmRNA.

דאמינציה של C (ע"י האנזים דאמינאז) שהופך ל-U. אם יש קודום שמקודד לח. אמינית, הוא יכול לשנות אותו ועל כן יש לכך חשיבות גדולה.
סוג אחר של עריכה, הוא דאמינציה של A, וקבלת נוקליאוטיד חדש במקומו -I=Inozine שנמצא בRNA.
האנזים שקורא את I חושב שהוא G ולכן זה דומה להפיכת A ל-G.
ADAV - שם האנזים שמחליף את A ב-I; הוא מתיישב על הmRNA ומזהה את הA המתאים ומבצע דאמינציה עליו.
חלבון Apolipoprotein-B (בקצרה ApoB) חשוב עבור חומצות שומן. באקסון 26 יש קודון שבmRNA שלו הוא מקודד לח. אמינו גלוטמין בכבד. במעי, לעומת זאת, יש תהליכי editing שבהם דאמינציה של C ונקבל UAA במקום CAA. הרצף UAA הוא סימן לעצירה (Stop-Codon) וכך נקבל במעי הגס חלבון בעל רצף קצר יותר.

תהליך הExport: אחרי שmRNA עובר ביגור ויש לתרגם אותו, הוא יוצא דרך שוער הגרעין ומגיע לציטופלסמה - שם הוא עובר תרגום לחלבון ומתפרק.
הmRNA מצופים בחלבונים הקשורים לספלייסינג וחלקם נושרים בדרך. יש חלבונים שמלווים אותו רק עד הציטופלסמה או רק בחלק מסויים בו נמצא הmRNA.
תהליך השעתוק הוא תהליך של יצור הmRNA, שתפקידו לקשר בין הDNA ליצירת חלבונים.

תרגום - Translation

התרגום מתרחש אך ורק בציטופלסמה. ה-mRNA כבר נוצר. הריבוזום קורא מקצה 5' לכיוון 3' : קודון-קודון.
לכל קודון הוא מביא tRNA, שיש לו 3 אתרים. tRNA יושב בריזובוזום ומביא איתו ח. אמינית. הריבוזום מורכב מ2 חלקים (גדול וקטו).

הקוד הגנטי

Degenerate Code - מצב שבו יש יותר מקודון אחד עבור אותה חומצת אמינו.
קיים רק רצף אחד שמקודד להתחלה: AUG, ולעומת זאת 3 רצפים שמקודדים לסיום (Stop Codons).

ביוכימיה - הרצאה (19.2.08)

שיעור #8

מבנה הDNA הוא מעין צורה שדומה לחרוזים על שרשרת. ה"חרוזים" הם הנוקליאוזום.
חוקרים גילו כי קיים קשר בין כמויות ההיסטונים השונים - יש כמויות כפולות של ההיסטונים H2,H3,H4 יותר מאשר H1.
אורך כל שרשרת כזו הוא כ100 אנגסטרם.
כאשר לקחו DNA ארוז בנוקליאוזום והוסיפו לו נוקליאז (DNAse שחותך DNA דו-גדילי) מצאו שהוא מסוגל לחתוך רק באזורים שבין הנוקליאוזום, וכך קיבלו DNA שהחלקים שאינם חתוכים בו הם ה"חרוזים" - הנוקליאוזומים. כל גודל של ליפוף (גודל של נוקליאוזום) כזה הוא 200bp.
ע"י הוסיפת DNAse לDNA בהדרגה, וראו שלחתיכות הDNA שנוצרו היה קל יותר לנוע בתוך הג'ל, וגודל הקפיצות הוא כ200bp. הסיקו מכך שמבנה הנוקליאוזום הוא של היסטונים וזהו אורכו.
היקף הDNA מסביב ל"חרוז" הוא 145bp והלינקר-DNA הוא באורך של 55bp.

בניסוי נוסף, הוציאו את ההיסטון H1 מכרומטין. כתוצאה מכך השתבש מבנה הנוקליאוזום, והמסקנה הייתה שH1 חיוני למבנה הקומפקטי והתקין של הנוקליאוזום.
DNA ארוז בכרומוזום ומכווץ פי 10,000 יותר מאשר בצורתו הרפויה.
ביצורים פרוקריוטים אין היסטונים מכיוון שאין להם גרעין.
בתאים אאוקריוטים קיימים 3 סוגי RNA-פולימראז (RNA-פולימראז 1, 2 ו- 3).

RNA-פולימראז-1 נמצא בגרעינון ומסנתז rRNA (רנ"א ריבוזומלי). הוא עובד בעיקר על מולקולות rRNA ויש לו פרומוטור אחד. הריבוזום מתרגם את הRNA לחלבון.
18s היא היחידה הקטנה שמרכיבה את הrRNA
28s היא היחידה הגדולה שמרכיבה את הrRNA. מורכב מ2 תת-יחידות נוספות: 5.8s, 5s

באאורקיוטים יש חזרות של גנים, ובהם יש אזורים שמקודדים לrRNA השונים, בינהם יש אזורים פחות חשובים בDNA.
RNA-פולימראז-1 משעתק ממנו Pre-Ribosomal-RNA - Pre-rRNA - 45s.
אנזימי RNAse מבשילים את ה Pre-rRNA ומשאירים ממנו 18s, 28s ו5.8s בוגרים שמרכיבים ביחד ריבוזום.

הrRNA יכול לעבור מודיפיקציות (מתילציות, למשל)
מולקולות Small-RNAs שקשורות לגרעינון משועתקות ע"י פול-,2 מביאות חלבונים לrRNA ומבצעות עליו מתילציה.
ע"י כך הן תורמות לתהליך ההבשלה שלו.
*תזכורת: כדי להגיע למצב ההתחלה (initiation) יש צורך בפקטורי שעתוק - TF
RNA-פולימראז-3 - מתיישב על הפרומוטור שלפני הגן שהוא רוצה לשעתק. לשם כך הוא נעזר בTF (פקטור שעתוק, Transcription Factor) - הפקטורים הם TF3A, TF3B.
RNA-פולימראז-3 גם משעתק את rRNA 5s אשר חלק מצבר מולקולות הrRNA בגרעינון.

שעתוק של 5s rRNA
דרוש גם TF3A בזמן שעתוק של 5s כדי שיוכל לזהות את הפרומוטור. TF3A מתיישב על הגן ונמביא אליו את TF3C, ואז TF3B יכול להגיע לגן. רק אז, האנזים יכול להתחיל בשעתוק.

דרך ל"כיבוי" הגן:
כאשר נוצרות הרבה מולקולות של 5s ויש עודף שלהן, הן מתלפפות עם הTF3A והוא מתלפף ונחסם, ואינו מסוגל להתיישב על הפרומוטור - מה שגורם להפסקה של פעילות הגן.

RNA-פולימראז-2 - אצל אאוקריוטים הפרומוטור גדול בהרבה מאשר אצל פרוקריוטים ומורכב יותר, מכיוון שנקשרים אליו יותר פקטורים.
אזור שנקרא GC BOX קיים הרבה אצל גנים מסוג Housekeeping, שמבוטאים בכל הרקמות בגוף ברצף הבקרה שלהם.
אצל גנים ספציפים לרקמה מסויימת (כמו גן שמייצר גלוקוז שנמצא בכבד) מצאו רצפי TATA Box.

כדי שתהליך הinitiation יצא לפועל, הRNA-פולימראז-2 צריך ליצר קודם קומפלקס שמורכב מ GTF - General Translation Factors או BTF - Basal Translation Factors.
הTATA Box ממוקם Upstream (לפני הגן). TF2D הוא הקומפלקס הראשון שמתיישב על הTATA Box ויש בו מספר חלבונים: TBP - TTA Binding Protein, חלבון שנקשר לTATA Box.
גם TATA Binding Associated Factors שהם קבוצה אחרת של חלבונים (אין צורך בפירוט..)
TF2A מתחבר למולקולה ומחזק את הקשר. TF2B מסמן לRNA-פולימראז-2 את המקום בו הוא צריך להתיישב (לפני הגן).
TF2F מגיע ביחד עם RNA-פולימראז-2 ועוזר לו להתחבר (מושך אותו לפרומוטור).
TF2H-הליקאז פותח את הDNA כדי לאפשר לאנזים להתיישב ב"נוח".
לאחר שכל הפקטורים האלו סיימו את תפקידם, האנזים יכול להתחיל לעבוד.
CTD - C Terminus Domain - הקצה הC של האנזים ארוך כמו זנב וזהו אחד החלקים החשובים אצלו. בגלל שהרבה פקטורים יכולים להקשר אל הזנב הזה, רואים שאי אפשר להתחיל בתהליך השעתוק לפני שהCTD עובר זרחון.

TBP - (מסומן כסליל ירוק במצגת) על הTATA Domain ומקפל את הDNA. כתוצאה מהקיפול, אפשר להביא חלבונים אחרים להתיישב על הDNA. הTBP משמש תמיד כ Pre Initiation Complex גם כאשר אין TATA Box ברצף. גנים עם פחות רצפי TATA מבוטאים בצורה נמוכה.
ידוע היום שכ 2/3 מהגנים לא מכילים רצפי TATA Box. יש אתר אחר שנקרא Initiator, ובכל זאת TBP משתתף.

תאי הגוף שלנו נוצרים מתאי אב (Stem Cells). תא אב מתמיין לתא אב יותר מבוגר.
בתא צעיר (Embrionic Cell) שמו לב שאין ביטוי של β-גלובין (גן שמפיק תאי דם), ולעומתו תא דם אדום כן מבטא β-גלובין. בניסוי שנערך ביטאו קטע DNA בכל אחד מהתאים האלו וגילו שהDNA מתא הדם האדום נחתך בקלות רבה יותר מאשר התא הצעיר.
המסקנה הייתה שיש הבדל באריזת הDNA אצל תא צעיר, שעדיין אין שימוש בגנים שלו לעומת תא דם אדום שאצלו קיימת נגישות גבוהה לDNA-פולימראז-2.
DNA בעל רגישות גבוהה יותר מכונה: "DNA Hyper Sensitive Site".
אצל תא כבד, אזור הβ-גלובין דחוס מכיוון שהוא לא עושה שימוש בגן הזה, לעומת תא אדום שאצלו האזור הזה פתוח.

Chromatine Remodelling - הDNA נפתח ונסגר באזורים מסויימים. זהו נושא חדש שנמצא במחקר. יש אוסף שלם של חלבונים "רעבים" לאנרגיה שמושקעת בפתיחה וסגירה של DNA וחלק גדול מהאנרגיה בתא, הATP משמש לכך.
התהליכים האלו נעזרים בהיסטונים. קצוות ההיסטונים בולטים החוצה, ועליהם מתרחשות מודיפיקציות (למשל: אצטילציה, מתילציה, פוספורילציה, יוביקויטינציה ועוד...) בהתאם לחומצה האמינית, והן גורמות לשינויים במטענים שמכווצים או פותחים את הDNA בהתאמה.
אצטילציה על היסטין 3 יכולה להוביל לפתיחת כרומטין. מתילציה לעומת זאת מביאה לסגירה.

DNA Enchancers & Silencers - במרחק של כ100bp מהפרומוטור, יכולים להשפיע על השעתוק.
אם הDNA מתקפל ומגיע לפרומוטור, פעולת Enhancement נשעית ע"י רצף כזה מחלבון שנקרא Activator שמגביר את פעילות הפולימראז וגורם לו לעבוד מהר יותר.
אם יש צורך להשתיק אזור מסויים, התא משתמש באזור של Silencer שנמצא רחוק יחסית מהגן. גן של רפרסור משפיע על קצב פעילות הפולימראז ומכבה אותו.
Co-Activator - קומפלקס של אקטיבטור.

ביוכימיה - הרצאה (12.2.08)

שיעור #6

קיימים 3 הבדלים עיקריים בין הכפלה לשעתוק:

• הRNA מורכב ומיוצר כגדיל אחד, לעומת הDNA שנמצא במצב דו-גדילי.
• בהכפלה יש צורך להכפיל את כל הגנים, ואילו בתהליך השעתוק רק חלק מסויים.
• בהכפלה יש צורך בדיוק מירבי, מכיוון שהחומר הגנטי המוכפל עובר לתאים חדשים.

בתהליכי השכפול ושעתוק הDNA קורות טעיות, ביחס של 1:1,000,000,000.
בRNA לעומת זאת, יחס הטעויות הוא כ 1:10,000.
mRNA - רנ"א שליח, או Messenger-RNA, הוא החלק שמקודד לחלבון ומהווה כ5% מהRNA בתא.
הtRNA אחראי להביא חומצות אמינו מתאימות בכל פעם לRNA.
rRNA - רנ"א ריבוזומלי מהווה חלק גדול מאחוז הRNA בתא.
Small RNAs - מולקולות RNA קטנטנות שמבקרות את פעולות הRNA בתא.

תהליך השעתוק מתחלק ל3 חלקים:

1. תחילת השעתוק (Initiation) - הRNA-פולימראז "מתיישב" על הגן הספציפי שאותו הוא משעתק.
2. ההכפלה, או ההארכה (Elongation) - התהליך עצמו בו הDNA מתארך.
3. סיום, טרמינציה (Termination) - סוף התהליך, בו השעתוק מסתיים (כיצד "יודע" הRNA מתי ואיך לעצור?)

שלב ההתחלה ושלב הסיום הם תהליכים מבוקרים.
בשנות השישים גילו לראשונה את מולקולת הRNA. מאוחר יותר גילו את מולקולות הריבוזומים ואת הmRNA.

גלקטוז וגלוקוז הם שני חומרים שהחיידק יודע לפרק ולנצל עבור אנרגיה. את הלקטוז החיידק מפרק בעזרת האנזים
β-גלקטוסידאז (קיימים עוד 2 אנזימים שמופרשים). האנזים הזה אינו מיוצר בכמויות גדולות אצל החיידק גם כאשר יש לו שפע של גלוקוז, אך כאשר יש לחיידק הרבה לקטוז, יש ייצור המוני של האנזים. מכאן הסיקו חוקרים, שהחיידק מגיב לשינויים סביבתיים ולפיכך יכול לשפעל או לכבות גן בהתאמה.
קיימת בקרה (או סיגנל) שגורם למולקולה מתווכת להעביר את הסיגנל הזה. המולקולה הזו מופיעה כשיש צורך ונעלמת כאשר אין יותר צורך בתהליך.

בניסוי שנערך נבדקו מס' מקרים בהם החיידקים מגיבים לסביבה:

1. מוטנט שגדל במצע ללא גלוקוז גורם לביטוי הקבוע של האנזימים המופרשים ללא קשר למצע עליו גדל החיידק.
2. חיידקים, שכאשר מוסיפים להם למצע לקטוז אינם מייצרים את האנזימים. (Non-Inducible)

מתוך כך הסיקו שקיימת מולקולה שמעבירה אות וכך מעכבת (Repressor) בשעת הצורך ומבקרת את ביטוי הגנים.
כאשר יש mRNA שצריך לקודד לחלבון, מולקולת הרפרסור גורמת לכך. אזור הקשירה של הרפרסור לDNA נקרא אופרטור (Operator).
לחיידקים יש אופרון (Operon) - יחידה בגנים שבה יש מספר גנים אחד ליד השני ברצף מיד לאחר רצף האופרטור.
בשלב הInitiation, הרפרסור יוצר mRNA שמקודד לחלבון רפרסור שמסוגל להצמד לאופרטור, וכך עוצר את
הRNA-פולימראז מלהצמד אליו ולסנתז אנזימים או חלבונים. כאשר הלקטוז נכנס למערכת, הוא נקשר לרפרסור ומשנה את המבנה שלו, ואז האופרטור חשוף לפעילות RNA-פולימראז, ואנזימים יכולים להיות מסונתזים ברצף האופרון.

בניסוי שבו התגלה הmRNA, הודבקו חיידקים בבקטריופאג' מסוג T2 השולט על החיידק, והוא החל לייצר RNA וחלבונים משל עצמו.
בשיטת Pulse Labelling (שיטה לזיהוי נוכחות מולקולות, בעיקר רנ"א שליח) השתמשו באיזוטופ P32, המסמן מולקולות DNA שהוכנסו לתאים. לאחר זמן מה הוציאו את החומר וראו כמה מולקולת רדיואקטיביות הוכנסו לתאים.
בניסוי עם RNA בחיידקים מדדו את כמות ה RNA שקיימת בתא, ומצאו שיש בעיקר 23s ו- 16s, שהן מולקולות RNA ריבוזומלי.
כשביצאו את הניסוי עם S ראדיואקטיבי ומדדו CPM, מצאו הרבה מולקולות RNA כתוצאה מהדבקת הבאקטריופאג'.
(CPM = Counts Per Minute) מולקולות אלו היו mRNA. מאוחר יותר התגלה שהן נוצרו ע"י הוירוס.

RNA-פולימראז

האנזים RNA-פולימראז יושב על הDNA, מפריד את שני הסלילים ומוסיך נוקליאוטידים טרי-פוספטים. הוא עובד בכיווניות 5' ל3'. אין צורך בפריימר - הוא מתחיל לעבוד מיד אחרי שהוא מתיישב על הDNA.
הגדיל הנגדי, המקודד, נקרא Sense (Coding) Strand.
הגדיל השני נקרא Anti-Sense (noncoding) Strand.
בחיידקים יש רק סוג אחד של האנזים הזה - RNAP, (או RNA-פולימראז-1).
ביצורים אאוקריוטים יש RNA-פולימראז-1, 2 ו3 שמייצרים rRNA, mRNA, ו-small RNAs.

ריפמיצין הוא חומר שמפסיק שעתוק של RNA אצל חיידקים ע"י עיכוב תת יחידה בטא של RNA-פולימראז. הוא לא עובד על RNA-פולימראז אצל יצורים אאוקריוטים.
אלפא-אמניטין הוא חומר שמעכב RNA-פולימראז אצל יצורים אאוקריוטים (בני אדם..). ברמות שונות, החומר יכול לעכב RNA-פולימראז שונים.
Cordycepin - חומר שגורם להפסקה של שעתוק בתאים. הוא דונה לאדנוזין (A), אך במקום 3'-OH, יש לו H ולכן הוא גורם לטרמינציה בשעתוק.
אקטינומיצין D - חומר שמעכב שעתוק (חזק מאוד). הוא נכנס לDNA ומתחבר אליו וסותם את ה minor groove.
ע"י כך הוא חוסם א הRNA-פולימראז ולא מאפשר לו לשעתק.

ההכפלה נעשית מהר, אך במעט מקומות בתא מכיוון שכמות הDNA-פולימראז-3 קטנה (כ10 מולקולות בתא בלבד).
קצב ההכפלה הוא כ 500-1000 נוקליאוטידים לשניה.
קיימות 3000 מולקולות RNA-פולימראז בתא, אך קצב העבודה שלהן איטי יותר - כ50 נוקליאוטידים לשניה.

RNA-פולימראז בפרוקריוטים
המולקולה העיקרית שמבצעת את תהליך השעתוק מורכבת מ2 תת-יחידות - אלפא ובתא (α, β). חלק זה נקרא Core-Polimerase. פקטורים נוספים יכולים להקשר אליו, כמו פקטור סיגמא.
פקטור סיגמא (σ) מקנה לאנזים את היכולת למצוא מקום ממנו הוא יוכל להתחיל לשעתק.
תהליך ה Scanning הוא בדיקת הDNA כדי למצוא פרומוטור, רצף בקרה שמצוי לפני כל תחילת גן. הפולימראז מתיישב על הפרומוטור, נצמד אליו כקומפלקס סגור ומתחיל לפרום את שני הגדילים. 8-9 בסיסים אחרי שהתהליך התחיל, עוזב פקטור סיגמא את הפולימראז, וזה ממשיך לעבוד עד סיום שעתוק הגן הרצוי, שם הוא עוצר.

מושגים
Upstream - האזור שמצוי לפני הגן עצמו.
Downstream - האזור שמצוי אחרי הגן. הנוקליאוטיד שממנו מתחיל התרגום הוא 1+.
Unwinding - פתיחת הDNA. האזור הפתוח הוא באורך של כ180 bp.
אצל חיידקים הנוקליאוטיד הראשון 1+ הוא בד"כ פורין (A או G).
UTR - אזור לא מתורגם (Untranslated Region). יכול להיות גם אזור בקרה.
Abortive Initiation - לפעמים הRNA-פולימראז מייצר מס' קטן של בסיסים, אבל מסיבה כלשהי התהליך לא עובד, והוא מפסיק, חוזר למקום ההתחלתי ומתחיל שוב את התהליך.
Active Site - האזור הפעיל באנזים בו מתרחשת תגובה ביוכימית. בRNA-פולימראז יש 2 יונים של MG+2 מהאתר הפעיל.
טופואיזומראז-1 - אנזים שמשחרר לחץ מאחורה.
טופואיזומראז-2 (נקרא גם גיראז, Girase) - משחרר לחץ מקדימה.
RNA-פולימראז משתהה לפעמים ומסוגל לחזור אחורה (Backtracking). כאשר הוא עושה זאת, גם פתיחת הDNA צריכה לחזור כמה שלבים אחורה. עדייו לא ברור מדוע זה קורה.

הפולימראז יכול לעשות "סליידינג" (Sliding) - להתעלם מהזנב שכבר נוצר ולהמשיך ליצור שוב.
יש אנזימים שחותכים את הזנב הקטן, ואז הוא מתחיל לשעתק שוב מההתחלה.
בrRNA יש חזרה של ייצור של יותר מRNA אחד בו זמנית.
בmRNA יש ייצור בודד (כאשר צריך).

Housekeeping Genes - גנים שמשועתקים בקצב קבוע, ללא קשר או תלות בגורמים חיצוניים והסביבה.
Inducible Genes - גנים שמשועתקים רק בשעת הצורך.
Concencus Sequence - רצף שכמעט תמיד מכיל את אותו רצף הפרומוטור. כאשר בחנו את האזורים הללו, מצאו אזורים דומים שפקטור סיגמא יכול לזהות.

בתהליך הטרמינציה (Termination) יש שני חלקים:

1. מבנה שניוני של RNA, Stemp Loop, גורם לפולימראז להשתנות. הRNA פולימראז אז יוצא ממקומו.
2. פקטור רהו (Ρ) - מולקולה שיוצרת טבעת, מתלבשת על הRNA ומחילקה עליו, מגיעה עד האזור שבו הפולימראז מחובר לRNA. היא פורמת את הקשר DNA-RNA, הם נפרדים והRNA-פולימראז נופל. תהליך זה מתרחש גם, ככל הנראה, באזורים שבהם האנזים משתהה.

ביוכימיה - הרצאה (10.2.08)

שיעור #5

DNA-פולימראז-2 מעורב בתהליכי תיקון DNA.
ככל שהטלומר (הרצף בקצה הDNA) ארוך יותר, כך התאים יכולים להתחלק יותר פעמים.
אצל בני אדם רצף הטלומר נראה כך: TTAGGG. אצל יצורים אחרים הרצף שונה מעט, אך קיים דמיון.

במשך שנים רבות הייתה הנחה שוירוסים מסויימים יכולים לגרום לסרטן ע"י שיבוש חלוקה של תאים.
החומר התורשתי של הוירוסים הללו היה RNA חד-גדילי, והחוקרים לא הבינו איך וירוסים משבשים פעילות DNA בתאים של בני אדם ואיך הגנום שלהם עובר אינטגרציה עם זה שלנו.
חוקר בריטי טען שהצליח לבודד אנזים שמסוגל לבצע פעולה הפוכה בוירוסים אלו - הפיכת RNA לDNA. לאנזים הזה קוראים DNA-Reverse-Transcriptase.
בקצוות הRNA יש רצפים משלימים. בשלב הראשון, אנזים משתמש במולקולת tRNA כפריימר כדי להשלים את הקטע החסר על לקצה של הגנום הלינארי.
בשלב הבא, האמזים RNAse-H מפרק RNA שנמצא בזיווג עם נוקליאוטידים משלימים עם מולקולת DNA. מוצר DNA ללא גדיל משלים, והוא עובר התעגלות. מתקבל מבנה של RNA ויראלי, עם DNA שיוכל לעבור הכפלה.
בעזרת יצירת גדיל נוסף יתקבל DNA משלים, וכך נוצר DNA דו גדילי שיכול לעבור מהוירס לגרעין התא של האורגניזם, ואף יכול לעבור אינטגרציה עם הגנום של הנדבק.
אצל נשא, ביטוי הDNA אינו גורם למחלה באופן ישיר.

פרק 25 בספר הלימוד - ארגון מחדש של האינפורמציה בDNA
אפיגנטיקה - נושא העוסק במידע נוסף, מעבר לזה שנמצע ברצף הנוקליאוטידים.
DNA מסוגל לעבור מתילציה - דבר הגורם לתא להתייחס לאינפורמציה בגן בצורה שונה.
חלבונים של כרומטין גם יכולים לבקר את האינפורמציה שמקודדת ע"י הDNA.

להלן מספר מושגים חשובים:
מודיפיקציה - שינויים אפיגנטים של הDNA.
רקומבינציה - שחלוף. במיוזה המתרחשת בתאי מין יש שחלוף מידע בין שני תאים ליצירת DNA שונה.
אמפליקציה - קטעים של DNA המוכפלים הרבה פעמים.
ארגון מחדש (Rearrangement) - קשור ליכולתו של הגוף ליצור נוגדים נגד כמעט כל פולש.
מתילציה - קישור קביצת מתיל לDNA. יכולה להתרחש רק לאחר שמולקולת DNA נוצרה.
מתילאזות - אנזימים שקושרים מתיל לDNA.


אצל חיידקים, המתילציה מתרחשת על החנקן שקשור לפחמן 6 של מולקולת האדנין. מולקולת המתיל נקשרת רק לאחר שהDNA נוצר. החנקן שקשור לפחמן 4 (מתיל ציטוזין) גם עובר מתילציה.
מתילציות מסוג זה נפוצות\ידועות אצל חיידקים והן נחשבות נורמליות או פיזיולוגיות.
המתילאזות מעורבות בתהליכי תיקון DNA. חלק ממנגנון התיקון של השברים בDNA קשור לתהליך מתילציה, בעיקר על אדנין. המתילציה גם מעורבת בתהליך תיקון DNA ובבקרה על השכפול והשעתוק. אצל חיידקים תהליך זה מגן על חיידק מפני פולשים, כמו וירוסים. במקרים מסויימים, חיידק הסלמונלה למשל, מתילציה גורמת לו להיות אלים יותר.
לגבי תאים אאוקריוטים - הנוקליאוטיד היחיד שעובר מתילציה במצב פיזיולוגי הוא הציטוזין. 5-מתיל-ציטוזין, על פחמן 5. בתאים של יונקים, ציטוזין שעבר מתילציה נמצא 5' לשייר של גואנין (G), כלומר, G נמצא מייד אחריו.

בתאים אנימליים:

DNA String: '3 CpG '5

P מסמן את הפוספט של הגואנין.
בתאים צמחיים הרצף יהיה:

DNA String: '3 CpNpG '5

N מסמן נוקליאוטיד כלשהו (לא משנה איזה נוקליאוטיד)

תבנית המתילציה של DNA נשמרת גם לאחר חלוקת התא. לאחר הכפלת הDNA, מתילאזות מוסיפות את המתיל על הגדיל המשלים במקום בו הייתה מתילציה לפני ההכפלה.
יש גנים שבהתפתחות העוברית מבוטאים ברמה גבוהה, אך לאחר הלידה הם מושתקים עד יומו האחרון של האורגניזם.
המוגלובין עוברי למשל, מפסיק להווצר לאחר הלידה ובמקומו מתחיל להווצר המוגלובין אחר.
5-Azacytozine הוא ציטוזין שלא יכול לעבור מתילציה, אך פרט לעובדה זו הוא זהה לציטוזין רגיל.
אם ההשתקה היא בגלל מתילציה, לאחר מספר חלוקות לא נצטרך יותר להשתמש בו, ואם הגן היה מופעל אז נדע שהמתילציה היא זו שגרמה להשתקה.
באמת ראו שהגנים שחשבו שמעורבים בבקרה של ביטוי החלו להתבטא, וכך אנו יודעים שמתילציה מעורבת בבקרת ביטוי של גנים.

האנזים מתילאז לוקח את קבוצת המתיל מהמולקולה Adomet ומלביש אותה על הציטוזין.
Genetic Imprinting - תהליך שבו אלל שמועבר מאחד ההורים יהיה משותק ע"י מתילציה, והאלל מההורה האחר יהיה פעיל.
בגמטות של זכר, יש מצב של דמטילציה - למרות שהאלל האימהי ממותל, בגמטות יש תהליך של הסרת המתיל, ולכן כל תא זרע שהזכר יתרום יהיה לא ממותל, והאלל הלא ממותל יהיה פעיל בדור הבא. אצל הנקבה המקרה הפוך.
קיים גם תהליך Imprinting הפוך, שבו האלל של האב מושתק, והאלל של האם מבוטא.

אם על גבי צלחת חיידקים נוסיף בקטריופאג'ים בכמות קטנה, כעבור זמן מה נקבל "פלאקים" - אזורים ריקים בתוך מרבד חיידקים. הפלאקים הם למעשה אזורים שבהם החייקים עברו ליזיס (פירוק).
Arber לקח בקטריופאג' וחיידקי E-Coli, ולקח חיידקים מתוך הפלאק והדביק אותם בצלחת חדשה.
חיידקים מזן B ידעו להתגונן מפני הפאג'ים, ואילו חיידקים מזן K הודבקו ע"י הבקטריופאג'.
לפי סוג החיידקים נוצרו פלאקים ברמות שונות, ומכך הסיק Arber שלחיידק יש מנגנון הגנה מפני פולשים חיצוניים.
אנדונוקליאזות (נקראים גם "אנזימי רסטריקציה" - מפרקים DNA) מזהים רצפים ספציפים, למשל, רצף GAATTC יפורק ע"י החיידק.
על הDNA העצמי של החיידק הוא מגן בעזרת מתילציה. אם חלה טעות והחיידק גורם לוירוס מתילציה, הוירוס יהיה עמיד בפני האנדונוקליאזות.
אנזימים אלו, מגבילים את הDNA שיכול להיות בתוך התא. הם יצרו מהפכה במחקר הביולוגי - חלק גדול מההנדסה הגנטית מבוססת על התגלית שלהם.

בעזרת האנזים ECO-R1 אפשר לחתוך פלסמיד האזור מסויים. לפני מספר שנים השתמשו באינסולין של חזירים כדי להזריק לחולי סוכרת, אך זה לא תמיד עבד, ולעתים אף גרם למוות.
בעזרת אנזים זה, ניתן לחתוך גן של אינסולין במקום שמייצר אינסולין וכך להעביר אותו לבני אדם חולי סוכרת.
הטכנולוגיה של שימוש באנזימי רסטריקציה היא הבסיס להנדסה גנטית!
לכל אנזים רסטריקציה יש רצף DNA שהוא מכיר. יש גם אנזימים כאלו שמכירים רצפים המכילים מתיל.

ביוכימיה - הרצאה (5.2.08)

שיעור #4

האנזים DNA-פולימראז מאריך את הפריימר. הגדיל שמתחיל מקצה 5' מוארך, והוא הגדיל המוביל.
הגדיל השני (ה Lagging Strand) משוכפל מקטעים-מקטעים (ע"י פריימרים של RNA) והאנזים הליקאז ממשיך לפתוח אותו וכך גם הוא מוארך.
קיים תהליך של סילוק פריימר הRNA, החלפתו בפריימר DNA והשלמת הרווחים בין הפריימירים שהוחלפו.
השעתוק והשכפול של שני הגדילי מבוצעים ע"י האנזים DNA-פולימראז-3.
DNA-פולימראז-1 מבצע את סילוק הפריימרים של הRNA והשלמת הרווחים.
בתהליך זה, באה לידי ביטוי פעילותו של DNA-פולימראז-1: קצה ה 5'-אקסונוקליאז משמש כ Nick-Translation.
הDomain הC-טרמינלי הוא בעל יכולת הProof-Reading, כלומר בודק אם הוכנס הנוקליאוטיד הנכון (הDNA נכנס לחריץ בחלבון רק אם הנוקליאוטיד האחרון שהוכנס שגוי, והוא מתוקן).
האנזים מסלק בעזרת ה5'-אקסונוקליאז את ה5' של הRNA ובמקומו קושר מקטע DNA לשרשרת במקום 3'.
בסופו של דבר, DNA-פולימראז-1 מחליף את כל הRNA בDNA.

לDNA-פולימראז-3 אין ממש פעילות של 3'-אקסונוקליאז. הוא מכיל 10 פוליפפטידים שונים.
תת היחידה ε (אפסילון) היא זו שמקנה לאנזים את יכולת הק'-אקסונוקליאז.
תת היחידה θ (טטה) - לא ברור בדיוק מה תפקידה.
תת היחידה ρ (רהו) משמשת כDomain ומקשרת בין שתי תתי יחידות פונקציונליות, ומאפשרת שכפול בקצב אחיד עבור שני הגדילים.
תת היחידה β (בטא) אחראית לכך שהProcessivity של הDNA-פולימראז-3 גבוה כל כך. היא מקיפה את הDNA בטבעת, וכך גם מונעת ממנו תזוזה בלתי רצויה. כל האזורים שפונים כלפי פנים הטבעת הם הידרופוביים, ומכיוון שהDNA גם הוא הידרופובי, הוא נשאר בטבעת.
תת היחידה χ (חי) בעלת מס' תפקידים - אחד מהם הוא לבצע התאמה בין חומצות האמינו.
שלוש תת יחידות נוספות, γ (גמא), δ (דלתא) ו- ψ (פסי) "טוענות" את הטבעת על הDNA.
כשמולקולת ATP נקשרת לאחת מהן היא גורמת לשינוי קונפורמטיבי בקומפלקס הזה. הפתיחה של הטבעת מתבצעת ע"י הקישור של תת היחידה γ לקומפלקס β. כאשר מולקולת DNA נכנסת לטבעת, מתבצעת הידרוליזה של ATP לADP, נגרם שינוי קונפורמטיבי, הקומפלקס עוזב את תת-היחידה β, והיא עוזבת. האנזים הכולל עכשיו קשור למולקולת הDNA בעזרת הטבעת ותהליך השכפול יכול לצאת לפועל.

על הגדיל המוביל (Leading Strand) מספיק לטעון את הטבעת פעם אחת בלבד בכדי לאפשר סינתוז שלו באופן רציף.
על הגדיל המשלים (Lagging Strand) יש צורך לטעון את הטבעת על כל מקטע אוקזקי שנוסף.
המסקנה העולה מכך היא, שגם לאנזים DNA-פולימראז-3 יש יכולת Proof-Reading.
השלב האחרון הוא חיבור מקטעי האוקזקי (כלומר לאחר שכל מקטעי הRNA הוחלפו בDNA).
האנזים DNA-ליגאז הוא זה שמבצע את חיבור מקטעי הDNA בתנאי שבקצה הק3' יש הידרוקסיל על-גבי פחמן מס' 3 של המולקולה, וקיים פוספט על קצה ה5'.
אם לפוספט-α לא הייתה אפשרות של מעבר האלקטרון, הקשר לא יכול לצאת לפועל.
ה DNA-ליגאז עובר אקטיבציה ע"י קישור של אדנין-מונופוספט. כשהליגאז נקשר לאזור השבר מתבצעת התקפה נוקליאופילית ומתקבל קשר פוספודיאסתרי.

ביצורים פרוקריוטים (חיידקים למשל):

טופואיזומראז - (מקבוצה TYPE-1) אנזים זה משחרר את המתח שנוצר על הסליל וסוגר את הגדיל שוב.
קבוצת TYPE-2 פותחת את הלולאה ומפרידה ממנה את מולקולת הDNA. לאחר מכן היא סוגרת את שני הגדילים בחזרה. משפחה זו של אנזימים פועלת גם על DNA מעגלי - האנזימים האלו אחראיים על שחרור קשרים מסובכים יותר כדי לשחרר לחץ.

ביצורים אאוקריוטים:

DNA-פולימראז-α אחראי על יצירת מקטעי אוקזקי.
DNA-פולימראז-1 מקושר עם הפרימאז. הפרימאז מייצר עבורו את הפריימר וכך הוא יכול להמשיך לשעתק.
DNA-פולימראז-β מעורב בתהליכי תיקון DNA. אצל חיידקים, DNA-פולימראז-2 מעורב גם כן בתהליכי תיקון.
DNA-פולימראז-γ אחראי על הכפלה של DNA-מיטוכונדריאלי. בחיידק אין מיטוכונדריאה ולכן אין לו אנזים מקביל.
DNA-פולימראז-δ אחראי על שכפול הגדיל המשלים.
DNA-פולימראז-ε הוא בעל תפקיד לא ברור...

לDNA-פולימראז-δ יש Processivity נמוך, אולם כאשר מחברים לו את הטבעת עם תת-היחידה β היעילות שלו עולה הצורה ניכרת.
ה ( PCNA - (Proliferating Cell Nuclear Antigen משמש כסמן לתאים מתחלקים במקרים רבים, כי רק תאים מתחלקים מכפילים את הDNA שלהם. הוא מגדיל את היעילות ומשמש כProcessivity-Promoting Factor.

האזור האחרון של הפריימר בDNA לינארי מהווה בעיה להשלמה מכיוון שאין עוד חלק לפניו.
בDNA של בקטריופאג', בקצוות 3' וגם 5' יש רצפים שחוזרים על עצמם והם משלימים. שני הקטעים נצמדים ומושלמים ע"י רצף משלים. בזמן השכפול כל וירוס מקבל עותק של כל הגנים.

במודל אחר, השייך לאדנו-וירוס נעשה שימוש בחלבון Terminal-Protein המשמש כפריימר מחוץ לDNA עצמו.
הוא משכפל גודל אחד בשלמותו ומורחק מהDNA. הגדיל הזה, בעל קצוות משלימים, עובר לצורה טבעתית, ובעזרת אנזים פריימר הוא עובר השלמה לגדיל משלים.

קיים מנגנון שמגביל את מספר הפעמים שניתן לחלק תאים. אצל בני האדם, בכל כרומוזום יש קומפלקס שנקרא "טלומר". בטלומר יש רצף DNA שחוזר על עצמו הרבה פעמים. האנזים טלומראז (סוג של DNA-פולימראז) מכיל בתוכו נוקליאוטידים ומוסיף בקצה 3' רצף שחוזר על עצמו פעמים רבות. רצף הטלומר שנוסף אינו מקודד ולכן אינו חשוב, כך שניתן "לקצץ" אותו.
אם לאחר מספר כלשהו של חלוקות תאים התקצר כל רצף הטלומר, מידע מקצה הDNA יאבד, מה שייגרום בסופו של דבר לאיבוד חלק מהגנים ולמוות של התאים. לכן, אורך החיים של התא, תלוי ברצף הטלומר.
קיימת השערה שלפיה הארכת רצף הטלומר יכולה להאריך חיי אדם.
הטלומראז פועל בשלב העוברי או בתאי גזע במוח העצם. לאחר השלב העוברי הוא מושתק.
הוספה בלתי מבוקרת של טלומראז עלולה לגרם לסרטן מכיוון שהוא ממשיך להאריך את רצף הטלומר, מה שגורם לחלוקה כמעט אינסופית של תאים.

ביוכימיה - הרצאה (3.2.08)

שיעור #3

DNA יכול להמצא בצורת ADNA, BDNA ו-ZDNA. מולקולה היברידית (מורכבת מRNA ו-DNA) תהיה בצורת ADNA ותמצא בסביבה מיימית. מבנה של BDNA מתאפשר כאשר החמצן על גבי פחמן 2 חסר. מבנה הZDNA מאופיין ע"י סיבוב הפוך (שמאלי), והפורינים שלו במצב SIN במקום ANTI, מה שמאפשר מתילציה היעילות גדולה יותר. בצורת ה HDNA, ניתן לקבל סליל משולש, או תלת-גדילי. הסיבה לכך ששני הגדילים של הDNA נשארים צמודים זה לזה היא שה-ΔH גדל טובת דנטורציה. ובכל זאת, יש לנו קשרי מימן שתורמים ΔH גדול יותר, מה שגורם ל ΔG להיות חיובי. קשרי המימן הם אלו שמייצבים את המבנה הדו-גדילי בשתי דרכים:

1. העלאת הטמפרטורה תורמת ל ΔG שלילי. היא יכולה לגרום להפרדה בין שני הגדילים, ומתוך כך לדנטורציה.
2. הקטנת החוזק היוני של התמיסה או הוצאת המלח מהתמיסה תתרום לדנטורציה מכיוון שפרמטר הדחייה יגדל.

שכפול DNA

הDNA בגרעין יכול לעבור שכפול ע"י הפרדת הגדילים (הכפלה קונסרטיבית), שעתוק לmRNA, t-RNA או מיקרו-RNA. יצירת המולקולות RNA על בסיס הDNA נקראת שעתוק או תעתוק (Transcription).
מולקולות אלו יוצאות מגרעין התא לציטופלסמה. במהלך השעתוק נוצרות מולקולות RNA, כאשר כיווניות יצירת הRNA היא תמיד מכיוון קצה 5' לכיוון 3' - הנוקליאוטיד החדש תמיד יתווסף בקצה של 3'.

הRNA-פולימראז פותח את הסליל הכפול, וריבונוקליאוטידים מתווספים עד שמולקולות הmRNA והtRNA יורדות. בסוף, מולקולת הmRNA יוצאת לציטופלסמה ומתורגמת לחלבון.
הריבוזום סורק את מולקולת ה mRNA עד שמגיע לקודון ההתחלה "AUG". אז מגיע tRNA עם חומצה אמינית אחרת מתאימה לבניית החלבון. החלבון תמיד נוצר מהקצה הN-טרמינלי לכיוון הקצה הC-טרמינלי.

תהליך שכפול הDNA קורה ב-3 שלבים עיקריים:

• התחלה (Initiation)
• שכפול (Chain elongation)
• סיום (Termination)

שכיחות המוטציות בתהליך השכפול נמוכה מאוד - קיים מנגנון המונע זאת. ישנה מוטציה "שקטה", אך מוטציה יכולה גם להיות מסוכנת ולשנות פעולה של חלבון בכמה דרכים. קיימת גם מוטצה טובה, חיובית שמקנה לאורגניזם יתרון - זו אחת התיאוריות של האבולוציה.
מערכות הדם, המין (אצל הזכר) והעור משכפלות תאים. התא צריך לדעת לסנכרן בין שכפול התא לבין שכפול הDNA.

מחקר שנערך על חיידק ה E-Coli בוצע על מנת להבין כיצד מתבצע התהליך.

• קצב השכפול הוא 850 נוקליאוטידים לשניה. אצל יונקים הקצב הוא 60-90 נוקליאוטידים לשניה.
• בDNA של חיידקים (DNA מעגלי) השכפול מתחיל מנקודה אחת. אצל בני אדם (DNA לינארי) יש עשרות עד מאות Origin of Replication, והשכפול מתבצע בו-זמנית מכמה נקודות.
• מחזור חלוקה של חיידק הוא כ-20 דקות, ומחזור שכפול DNA הוא כ-40 דקות.

השכפול מתחיל ע"י הפרדה בין 2 הגדילים, שיוצרת מזלג הכפלה.
בהנחה שהשכפול מתבצע בכל גדיל בו-זמנית, הכיוונים הפוכים.
לקחו DNA מעגלי (הנמצא בחיידקים, וירוסים ובקטריופאג'ים) בזמן ההכפלה ובדקו את זמן ההתחלה והסיום של התהליך. לקראת סיום ההכפלה, הוסיפו למצע החיידקים נוקליאוטידים המסומנים בטרידיום (איזוטופ של מימן, H). אם ההוספה הייתה לקראת סיום ההכפלה ומעט לפני הכפלה חדשה, היה מתקבל אזור יחיד מסומן בDNA. אם ההכפלה היית ל-2 כיוונים היינו מקבלים 2 סימונים רדיואקטיביים.
ניסוי דומה נעשה על חיידק עם פלסמיד (DNA חוץ מעגלי, שאינו חלק מהגנום הכרומוזומלי של החיידק).
פלסמיד יכול לעבור אינטגרציה לתוך DNA הכרומוזומלי של האורגניזם, וכך להיות מוכפל ביחד עם הDNA המקורי, ואף להשתלב לצמיתות בDNA המקורי. פלסמיד שעבר אינטגרציה כזו נקרא אפיזום.
לפלסמיד יש Origin of Replication משל עצמו. קיים מנגנון שבו הOOR של האפיזום מושתק, והOOR של החיידק הוא זה שממנו מתחילה ההכפלה.
הOOR הוא תלוי רצף. ישנם רצפים מסויימים שאם נכניס אותם לתוך הDNA הם יתחילו מאותו OOR. רצף זה צריך להיות מוכר ע"י חלבונים ספציפיים.
בהרבה יצורים הצליחו לאפיין את הרצף ע"י הוצאת מקטע מתוך הרצף, וכתצאה מכך הOOR השתנה.
רצף הOOR מוכר ע"י חלבונים - הם נקשרים אליו ומגייסים את שאר החלבונים לתהליך השכפול.
בזמן החלוקה, הDNA כבר נמצא באמצע תהליך ההכפלה של המחזור הבא.
כאשר שני הגדילים פתוחים, מתחיל תהליך השכפול מכיוון 5' לכיוון 3' בגדיל המוביל (Leading Strand). בגדיל המשלים (Lagging Strand) יש שימוש במקטעי אוקזקי - הגדיל מייצר מקטע קצר בכל פעם.

האנזים DNA-פולימראז מאריך שרשרת קיימת של DNA. לשם כך, יש צורך באנזים נוסף, פרימאז (Primase), שמייצר פריימר מסוג RNA.
ב Lagging Strand נעשה שימוש בהרבה פריימרים, בכל פעם באזור ה5' של מקטעי האוקזקי. לכן, האנזים שפותח את הסליל, הליקאז (Helicase) צמוד לפרימאז.
פרימוזום (Primosome) הוא קומפלקס של פרימאז והליקאז.
על כל גדיל של DNA יש DNA-פולימראז. שני האנזימים האלו (אחד על כל גדיל) מחוברים גם הם בקומפלקס אחד, ולמרות שכל אחד מהם משכפל לכיוון נגדי, הם נעים לאותו כיוון של מזלג ההכפלה כדי שיוכלו לשכפל את שני הגדילים בקצב אחיד.

SSDBP - Single-Stranded DNA Binding Proteins

אחרי שאנזימי ההליקאז פתחו את הDNA, יש שני גדילים "עצמאיים". כדי למנוע את הצמדות הגדילים מחדש, צריך לייצב את המבנה החד-גדילי, ולאפשר קשרי מימן בין הנוקליאוטידים החדשים.
השכפול תמיד מתבצע מכיוון 5' ל3'. נוקליאוטיד חדש תמיד מגיע כ- טרינוקליאוטיד המתווסף לקצה 3'.
ה α-פוספט הוא הפוספט שקשור לקצה 5 של הסוכר.
בקצה ה3' יש קבוצת OH פנויה. אם אין כזו קבוצה פנויה, אי אפשר להאריך את השרשרת, כי כאשר נוקליאוטיד חדש מגיע עם GTP, הG מזהה את הC בעזרת SSDBP, ולאחר הזיהוי יש התקפה נוקליאופילית על הפוספט, והוא מוותר על האלקטרונים של הקשר, ויוצר קשר בין שני הנוקליאוטידים ע"י שחרור הדיפוספט, כך שקיבלנו תוספת נוקליאוטיד לשרשרת עם קבוצת OH פנויה נוספת.

לגבי ה Lagging Strand: הבעיה היא שצריך לסלק פריימרים של RNA. לאחר מכן, צריך להשלים את הפער עם דיאוקסינוקליאוטידים ולסגור את המולקולה.

שלושת האנזימים העיקריים בתהליך הם:
DNA-פולימראז-1: מקודד ע"י הגן פול-A
DNA-פולימראז-2: מקודד ע"י הגן פול-P
DNA-פולימראז-3: מקודד ע"י הגן פול-C

Processivity - מושג שמייצג את מספר הנוקליאוטידים שהאנזים יכול להוסיף למולקולה לפני שהוא נופל ממנו (או לפני שהוא מאבד את יכולת הפעולה שלו).
DNA-פולימראז-3 הוא האנזים בעל קצב העבודה הגבוהה ביותר מבין השלושה, ואצל חיידקים הוא מבצע את כל עבודת השכפול.
DNA-פולימראז-1 ממלא את הרווחים (Gaps) במקום הפריימרים של הRNA.
יש לו 3 פעולות שונות:

1. פעילות של DNA-פולימראז - הלבשת קצה על שרשרת DNA.
2. פעילות של 3'-אקסונוקליאז - בדיקה שהוכנס הנוקליאוטיד המתאים. אם הוכנס נוקליאוטיד שגוי, האנזים יחתוך אותו ויכניס נוקליאוטיד נכון במקומו. זהו מנגנון נגד מוטציות.
3. פעילות 5'-אקסונוקליאז - פעילות של חיתוך מולקולות מקצה ה5' של המולקולה.

בין שני מקטעי אוקזקי, יש אזור קצר בו הDNA לא מחובר. בנקודה זו נכנס הDNA-פולימראז-1 לפעולה: הוא מוריד את הנוקליאוטיד הראשון בפריימר של ה-RNA - הורדה של נוקליאוטיד מקצה 5', והוספת נוקליאוטיד לקצה 3'.

OOR* = Origin of Replication