ביוכימיה - הרצאה (19.2.08)

שיעור #8

מבנה הDNA הוא מעין צורה שדומה לחרוזים על שרשרת. ה"חרוזים" הם הנוקליאוזום.
חוקרים גילו כי קיים קשר בין כמויות ההיסטונים השונים - יש כמויות כפולות של ההיסטונים H2,H3,H4 יותר מאשר H1.
אורך כל שרשרת כזו הוא כ100 אנגסטרם.
כאשר לקחו DNA ארוז בנוקליאוזום והוסיפו לו נוקליאז (DNAse שחותך DNA דו-גדילי) מצאו שהוא מסוגל לחתוך רק באזורים שבין הנוקליאוזום, וכך קיבלו DNA שהחלקים שאינם חתוכים בו הם ה"חרוזים" - הנוקליאוזומים. כל גודל של ליפוף (גודל של נוקליאוזום) כזה הוא 200bp.
ע"י הוסיפת DNAse לDNA בהדרגה, וראו שלחתיכות הDNA שנוצרו היה קל יותר לנוע בתוך הג'ל, וגודל הקפיצות הוא כ200bp. הסיקו מכך שמבנה הנוקליאוזום הוא של היסטונים וזהו אורכו.
היקף הDNA מסביב ל"חרוז" הוא 145bp והלינקר-DNA הוא באורך של 55bp.

בניסוי נוסף, הוציאו את ההיסטון H1 מכרומטין. כתוצאה מכך השתבש מבנה הנוקליאוזום, והמסקנה הייתה שH1 חיוני למבנה הקומפקטי והתקין של הנוקליאוזום.
DNA ארוז בכרומוזום ומכווץ פי 10,000 יותר מאשר בצורתו הרפויה.
ביצורים פרוקריוטים אין היסטונים מכיוון שאין להם גרעין.
בתאים אאוקריוטים קיימים 3 סוגי RNA-פולימראז (RNA-פולימראז 1, 2 ו- 3).

RNA-פולימראז-1 נמצא בגרעינון ומסנתז rRNA (רנ"א ריבוזומלי). הוא עובד בעיקר על מולקולות rRNA ויש לו פרומוטור אחד. הריבוזום מתרגם את הRNA לחלבון.
18s היא היחידה הקטנה שמרכיבה את הrRNA
28s היא היחידה הגדולה שמרכיבה את הrRNA. מורכב מ2 תת-יחידות נוספות: 5.8s, 5s

באאורקיוטים יש חזרות של גנים, ובהם יש אזורים שמקודדים לrRNA השונים, בינהם יש אזורים פחות חשובים בDNA.
RNA-פולימראז-1 משעתק ממנו Pre-Ribosomal-RNA - Pre-rRNA - 45s.
אנזימי RNAse מבשילים את ה Pre-rRNA ומשאירים ממנו 18s, 28s ו5.8s בוגרים שמרכיבים ביחד ריבוזום.

הrRNA יכול לעבור מודיפיקציות (מתילציות, למשל)
מולקולות Small-RNAs שקשורות לגרעינון משועתקות ע"י פול-,2 מביאות חלבונים לrRNA ומבצעות עליו מתילציה.
ע"י כך הן תורמות לתהליך ההבשלה שלו.
*תזכורת: כדי להגיע למצב ההתחלה (initiation) יש צורך בפקטורי שעתוק - TF
RNA-פולימראז-3 - מתיישב על הפרומוטור שלפני הגן שהוא רוצה לשעתק. לשם כך הוא נעזר בTF (פקטור שעתוק, Transcription Factor) - הפקטורים הם TF3A, TF3B.
RNA-פולימראז-3 גם משעתק את rRNA 5s אשר חלק מצבר מולקולות הrRNA בגרעינון.

שעתוק של 5s rRNA
דרוש גם TF3A בזמן שעתוק של 5s כדי שיוכל לזהות את הפרומוטור. TF3A מתיישב על הגן ונמביא אליו את TF3C, ואז TF3B יכול להגיע לגן. רק אז, האנזים יכול להתחיל בשעתוק.

דרך ל"כיבוי" הגן:
כאשר נוצרות הרבה מולקולות של 5s ויש עודף שלהן, הן מתלפפות עם הTF3A והוא מתלפף ונחסם, ואינו מסוגל להתיישב על הפרומוטור - מה שגורם להפסקה של פעילות הגן.

RNA-פולימראז-2 - אצל אאוקריוטים הפרומוטור גדול בהרבה מאשר אצל פרוקריוטים ומורכב יותר, מכיוון שנקשרים אליו יותר פקטורים.
אזור שנקרא GC BOX קיים הרבה אצל גנים מסוג Housekeeping, שמבוטאים בכל הרקמות בגוף ברצף הבקרה שלהם.
אצל גנים ספציפים לרקמה מסויימת (כמו גן שמייצר גלוקוז שנמצא בכבד) מצאו רצפי TATA Box.

כדי שתהליך הinitiation יצא לפועל, הRNA-פולימראז-2 צריך ליצר קודם קומפלקס שמורכב מ GTF - General Translation Factors או BTF - Basal Translation Factors.
הTATA Box ממוקם Upstream (לפני הגן). TF2D הוא הקומפלקס הראשון שמתיישב על הTATA Box ויש בו מספר חלבונים: TBP - TTA Binding Protein, חלבון שנקשר לTATA Box.
גם TATA Binding Associated Factors שהם קבוצה אחרת של חלבונים (אין צורך בפירוט..)
TF2A מתחבר למולקולה ומחזק את הקשר. TF2B מסמן לRNA-פולימראז-2 את המקום בו הוא צריך להתיישב (לפני הגן).
TF2F מגיע ביחד עם RNA-פולימראז-2 ועוזר לו להתחבר (מושך אותו לפרומוטור).
TF2H-הליקאז פותח את הDNA כדי לאפשר לאנזים להתיישב ב"נוח".
לאחר שכל הפקטורים האלו סיימו את תפקידם, האנזים יכול להתחיל לעבוד.
CTD - C Terminus Domain - הקצה הC של האנזים ארוך כמו זנב וזהו אחד החלקים החשובים אצלו. בגלל שהרבה פקטורים יכולים להקשר אל הזנב הזה, רואים שאי אפשר להתחיל בתהליך השעתוק לפני שהCTD עובר זרחון.

TBP - (מסומן כסליל ירוק במצגת) על הTATA Domain ומקפל את הDNA. כתוצאה מהקיפול, אפשר להביא חלבונים אחרים להתיישב על הDNA. הTBP משמש תמיד כ Pre Initiation Complex גם כאשר אין TATA Box ברצף. גנים עם פחות רצפי TATA מבוטאים בצורה נמוכה.
ידוע היום שכ 2/3 מהגנים לא מכילים רצפי TATA Box. יש אתר אחר שנקרא Initiator, ובכל זאת TBP משתתף.

תאי הגוף שלנו נוצרים מתאי אב (Stem Cells). תא אב מתמיין לתא אב יותר מבוגר.
בתא צעיר (Embrionic Cell) שמו לב שאין ביטוי של β-גלובין (גן שמפיק תאי דם), ולעומתו תא דם אדום כן מבטא β-גלובין. בניסוי שנערך ביטאו קטע DNA בכל אחד מהתאים האלו וגילו שהDNA מתא הדם האדום נחתך בקלות רבה יותר מאשר התא הצעיר.
המסקנה הייתה שיש הבדל באריזת הDNA אצל תא צעיר, שעדיין אין שימוש בגנים שלו לעומת תא דם אדום שאצלו קיימת נגישות גבוהה לDNA-פולימראז-2.
DNA בעל רגישות גבוהה יותר מכונה: "DNA Hyper Sensitive Site".
אצל תא כבד, אזור הβ-גלובין דחוס מכיוון שהוא לא עושה שימוש בגן הזה, לעומת תא אדום שאצלו האזור הזה פתוח.

Chromatine Remodelling - הDNA נפתח ונסגר באזורים מסויימים. זהו נושא חדש שנמצא במחקר. יש אוסף שלם של חלבונים "רעבים" לאנרגיה שמושקעת בפתיחה וסגירה של DNA וחלק גדול מהאנרגיה בתא, הATP משמש לכך.
התהליכים האלו נעזרים בהיסטונים. קצוות ההיסטונים בולטים החוצה, ועליהם מתרחשות מודיפיקציות (למשל: אצטילציה, מתילציה, פוספורילציה, יוביקויטינציה ועוד...) בהתאם לחומצה האמינית, והן גורמות לשינויים במטענים שמכווצים או פותחים את הDNA בהתאמה.
אצטילציה על היסטין 3 יכולה להוביל לפתיחת כרומטין. מתילציה לעומת זאת מביאה לסגירה.

DNA Enchancers & Silencers - במרחק של כ100bp מהפרומוטור, יכולים להשפיע על השעתוק.
אם הDNA מתקפל ומגיע לפרומוטור, פעולת Enhancement נשעית ע"י רצף כזה מחלבון שנקרא Activator שמגביר את פעילות הפולימראז וגורם לו לעבוד מהר יותר.
אם יש צורך להשתיק אזור מסויים, התא משתמש באזור של Silencer שנמצא רחוק יחסית מהגן. גן של רפרסור משפיע על קצב פעילות הפולימראז ומכבה אותו.
Co-Activator - קומפלקס של אקטיבטור.

ביוכימיה - הרצאה (12.2.08)

שיעור #6

קיימים 3 הבדלים עיקריים בין הכפלה לשעתוק:

• הRNA מורכב ומיוצר כגדיל אחד, לעומת הDNA שנמצא במצב דו-גדילי.
• בהכפלה יש צורך להכפיל את כל הגנים, ואילו בתהליך השעתוק רק חלק מסויים.
• בהכפלה יש צורך בדיוק מירבי, מכיוון שהחומר הגנטי המוכפל עובר לתאים חדשים.

בתהליכי השכפול ושעתוק הDNA קורות טעיות, ביחס של 1:1,000,000,000.
בRNA לעומת זאת, יחס הטעויות הוא כ 1:10,000.
mRNA - רנ"א שליח, או Messenger-RNA, הוא החלק שמקודד לחלבון ומהווה כ5% מהRNA בתא.
הtRNA אחראי להביא חומצות אמינו מתאימות בכל פעם לRNA.
rRNA - רנ"א ריבוזומלי מהווה חלק גדול מאחוז הRNA בתא.
Small RNAs - מולקולות RNA קטנטנות שמבקרות את פעולות הRNA בתא.

תהליך השעתוק מתחלק ל3 חלקים:

1. תחילת השעתוק (Initiation) - הRNA-פולימראז "מתיישב" על הגן הספציפי שאותו הוא משעתק.
2. ההכפלה, או ההארכה (Elongation) - התהליך עצמו בו הDNA מתארך.
3. סיום, טרמינציה (Termination) - סוף התהליך, בו השעתוק מסתיים (כיצד "יודע" הRNA מתי ואיך לעצור?)

שלב ההתחלה ושלב הסיום הם תהליכים מבוקרים.
בשנות השישים גילו לראשונה את מולקולת הRNA. מאוחר יותר גילו את מולקולות הריבוזומים ואת הmRNA.

גלקטוז וגלוקוז הם שני חומרים שהחיידק יודע לפרק ולנצל עבור אנרגיה. את הלקטוז החיידק מפרק בעזרת האנזים
β-גלקטוסידאז (קיימים עוד 2 אנזימים שמופרשים). האנזים הזה אינו מיוצר בכמויות גדולות אצל החיידק גם כאשר יש לו שפע של גלוקוז, אך כאשר יש לחיידק הרבה לקטוז, יש ייצור המוני של האנזים. מכאן הסיקו חוקרים, שהחיידק מגיב לשינויים סביבתיים ולפיכך יכול לשפעל או לכבות גן בהתאמה.
קיימת בקרה (או סיגנל) שגורם למולקולה מתווכת להעביר את הסיגנל הזה. המולקולה הזו מופיעה כשיש צורך ונעלמת כאשר אין יותר צורך בתהליך.

בניסוי שנערך נבדקו מס' מקרים בהם החיידקים מגיבים לסביבה:

1. מוטנט שגדל במצע ללא גלוקוז גורם לביטוי הקבוע של האנזימים המופרשים ללא קשר למצע עליו גדל החיידק.
2. חיידקים, שכאשר מוסיפים להם למצע לקטוז אינם מייצרים את האנזימים. (Non-Inducible)

מתוך כך הסיקו שקיימת מולקולה שמעבירה אות וכך מעכבת (Repressor) בשעת הצורך ומבקרת את ביטוי הגנים.
כאשר יש mRNA שצריך לקודד לחלבון, מולקולת הרפרסור גורמת לכך. אזור הקשירה של הרפרסור לDNA נקרא אופרטור (Operator).
לחיידקים יש אופרון (Operon) - יחידה בגנים שבה יש מספר גנים אחד ליד השני ברצף מיד לאחר רצף האופרטור.
בשלב הInitiation, הרפרסור יוצר mRNA שמקודד לחלבון רפרסור שמסוגל להצמד לאופרטור, וכך עוצר את
הRNA-פולימראז מלהצמד אליו ולסנתז אנזימים או חלבונים. כאשר הלקטוז נכנס למערכת, הוא נקשר לרפרסור ומשנה את המבנה שלו, ואז האופרטור חשוף לפעילות RNA-פולימראז, ואנזימים יכולים להיות מסונתזים ברצף האופרון.

בניסוי שבו התגלה הmRNA, הודבקו חיידקים בבקטריופאג' מסוג T2 השולט על החיידק, והוא החל לייצר RNA וחלבונים משל עצמו.
בשיטת Pulse Labelling (שיטה לזיהוי נוכחות מולקולות, בעיקר רנ"א שליח) השתמשו באיזוטופ P32, המסמן מולקולות DNA שהוכנסו לתאים. לאחר זמן מה הוציאו את החומר וראו כמה מולקולת רדיואקטיביות הוכנסו לתאים.
בניסוי עם RNA בחיידקים מדדו את כמות ה RNA שקיימת בתא, ומצאו שיש בעיקר 23s ו- 16s, שהן מולקולות RNA ריבוזומלי.
כשביצאו את הניסוי עם S ראדיואקטיבי ומדדו CPM, מצאו הרבה מולקולות RNA כתוצאה מהדבקת הבאקטריופאג'.
(CPM = Counts Per Minute) מולקולות אלו היו mRNA. מאוחר יותר התגלה שהן נוצרו ע"י הוירוס.

RNA-פולימראז

האנזים RNA-פולימראז יושב על הDNA, מפריד את שני הסלילים ומוסיך נוקליאוטידים טרי-פוספטים. הוא עובד בכיווניות 5' ל3'. אין צורך בפריימר - הוא מתחיל לעבוד מיד אחרי שהוא מתיישב על הDNA.
הגדיל הנגדי, המקודד, נקרא Sense (Coding) Strand.
הגדיל השני נקרא Anti-Sense (noncoding) Strand.
בחיידקים יש רק סוג אחד של האנזים הזה - RNAP, (או RNA-פולימראז-1).
ביצורים אאוקריוטים יש RNA-פולימראז-1, 2 ו3 שמייצרים rRNA, mRNA, ו-small RNAs.

ריפמיצין הוא חומר שמפסיק שעתוק של RNA אצל חיידקים ע"י עיכוב תת יחידה בטא של RNA-פולימראז. הוא לא עובד על RNA-פולימראז אצל יצורים אאוקריוטים.
אלפא-אמניטין הוא חומר שמעכב RNA-פולימראז אצל יצורים אאוקריוטים (בני אדם..). ברמות שונות, החומר יכול לעכב RNA-פולימראז שונים.
Cordycepin - חומר שגורם להפסקה של שעתוק בתאים. הוא דונה לאדנוזין (A), אך במקום 3'-OH, יש לו H ולכן הוא גורם לטרמינציה בשעתוק.
אקטינומיצין D - חומר שמעכב שעתוק (חזק מאוד). הוא נכנס לDNA ומתחבר אליו וסותם את ה minor groove.
ע"י כך הוא חוסם א הRNA-פולימראז ולא מאפשר לו לשעתק.

ההכפלה נעשית מהר, אך במעט מקומות בתא מכיוון שכמות הDNA-פולימראז-3 קטנה (כ10 מולקולות בתא בלבד).
קצב ההכפלה הוא כ 500-1000 נוקליאוטידים לשניה.
קיימות 3000 מולקולות RNA-פולימראז בתא, אך קצב העבודה שלהן איטי יותר - כ50 נוקליאוטידים לשניה.

RNA-פולימראז בפרוקריוטים
המולקולה העיקרית שמבצעת את תהליך השעתוק מורכבת מ2 תת-יחידות - אלפא ובתא (α, β). חלק זה נקרא Core-Polimerase. פקטורים נוספים יכולים להקשר אליו, כמו פקטור סיגמא.
פקטור סיגמא (σ) מקנה לאנזים את היכולת למצוא מקום ממנו הוא יוכל להתחיל לשעתק.
תהליך ה Scanning הוא בדיקת הDNA כדי למצוא פרומוטור, רצף בקרה שמצוי לפני כל תחילת גן. הפולימראז מתיישב על הפרומוטור, נצמד אליו כקומפלקס סגור ומתחיל לפרום את שני הגדילים. 8-9 בסיסים אחרי שהתהליך התחיל, עוזב פקטור סיגמא את הפולימראז, וזה ממשיך לעבוד עד סיום שעתוק הגן הרצוי, שם הוא עוצר.

מושגים
Upstream - האזור שמצוי לפני הגן עצמו.
Downstream - האזור שמצוי אחרי הגן. הנוקליאוטיד שממנו מתחיל התרגום הוא 1+.
Unwinding - פתיחת הDNA. האזור הפתוח הוא באורך של כ180 bp.
אצל חיידקים הנוקליאוטיד הראשון 1+ הוא בד"כ פורין (A או G).
UTR - אזור לא מתורגם (Untranslated Region). יכול להיות גם אזור בקרה.
Abortive Initiation - לפעמים הRNA-פולימראז מייצר מס' קטן של בסיסים, אבל מסיבה כלשהי התהליך לא עובד, והוא מפסיק, חוזר למקום ההתחלתי ומתחיל שוב את התהליך.
Active Site - האזור הפעיל באנזים בו מתרחשת תגובה ביוכימית. בRNA-פולימראז יש 2 יונים של MG+2 מהאתר הפעיל.
טופואיזומראז-1 - אנזים שמשחרר לחץ מאחורה.
טופואיזומראז-2 (נקרא גם גיראז, Girase) - משחרר לחץ מקדימה.
RNA-פולימראז משתהה לפעמים ומסוגל לחזור אחורה (Backtracking). כאשר הוא עושה זאת, גם פתיחת הDNA צריכה לחזור כמה שלבים אחורה. עדייו לא ברור מדוע זה קורה.

הפולימראז יכול לעשות "סליידינג" (Sliding) - להתעלם מהזנב שכבר נוצר ולהמשיך ליצור שוב.
יש אנזימים שחותכים את הזנב הקטן, ואז הוא מתחיל לשעתק שוב מההתחלה.
בrRNA יש חזרה של ייצור של יותר מRNA אחד בו זמנית.
בmRNA יש ייצור בודד (כאשר צריך).

Housekeeping Genes - גנים שמשועתקים בקצב קבוע, ללא קשר או תלות בגורמים חיצוניים והסביבה.
Inducible Genes - גנים שמשועתקים רק בשעת הצורך.
Concencus Sequence - רצף שכמעט תמיד מכיל את אותו רצף הפרומוטור. כאשר בחנו את האזורים הללו, מצאו אזורים דומים שפקטור סיגמא יכול לזהות.

בתהליך הטרמינציה (Termination) יש שני חלקים:

1. מבנה שניוני של RNA, Stemp Loop, גורם לפולימראז להשתנות. הRNA פולימראז אז יוצא ממקומו.
2. פקטור רהו (Ρ) - מולקולה שיוצרת טבעת, מתלבשת על הRNA ומחילקה עליו, מגיעה עד האזור שבו הפולימראז מחובר לRNA. היא פורמת את הקשר DNA-RNA, הם נפרדים והRNA-פולימראז נופל. תהליך זה מתרחש גם, ככל הנראה, באזורים שבהם האנזים משתהה.