ביוכימיה - הרצאה (24.2.08)

שיעור #9

לא ידוע אם יש הליקאז לפני RNA-פולימראז-3. לפני RNA-פולימראז-2 קיים הליקאז.
מלבד הפקטורים הבסיסיים (Basal Factors) בכל פתיחה של גן עבוד RNA-פולימראז-2, יש כאלו ספציפיים לרצף מסויים באזור הפרומוטור. בנוסף ל TATA Box, לגן כלשהו יהיה פקטור מסויים. הפקטור הזה מגביר את התדירות שהפרומוטור שולח לפולימראז, כך שהוא יוציא mRNA בתדירות גבוהה יותר.

פקטורי השעתוק האלו קשורים לאקטיבטורים ולרפרסורים (כולם קשורים זה לזה בצורה כלשהי) ולPre Initiation Complex.
פקטור שעתוק מכיל אזור שקושר DNA - זהו אזור חלבוני שנקשר לMajor Groove ונצמד אליו ע"י כך שהו מזהה רצף פנימי בתוכו. הוא נקשר כדימר (זוג חלבונים) לDNA. אזור זה בפקטור השעתוק נקרא DNA Binding Domain.
החלק השני, הActivation Domain, אינו קושר DNA, אבל קושר חלבונים אחרים - פקטורי שעתוק אחרים או אקטיבטורים. הקשרים האלו יוצרים את הפעילות האקטיבית של הפרומוטור.
שני פקטורים יכולים להשפיע ביחד ברמה של מכפלת היעילות של שניהם (אם אחד מגדיל את היעילות פי 5, והשני מגדיל את היעילות פי 10, אז שניהם ביחד מגדילים את היעילות פי 50).

הגן ציקלין-D1 קשור למחזור התא; הבקרה על הביטוי שלו מאוד ייחודית. פקטורים מסויימים יכולים לגרום לייצור עודף שלו, ואחרים יכולים לגרום למוטציות שמבטלות אותו או גורמות לבעיות.

אופן הקשירה לDNA
קיים מבנה ספציפי יודע לקשור את החלבון.
בחלבון יש אזור שנקרא Zinc Finger שיודע לקשור את הDNA.
חלבון מסוג כזה הוא TF3A. ע"י הכנסת יון אבץ לתוך סליל של חומצת אמינו, נוצרת מעין לולאה בצורת אצבע (שמורכבת מHis ו Cys). האצבע נכנסת לMajor Groove בDNA ונקשרת אליו. זהו למעשה הDNA Binding Domain.
לחלבון אחד יכולות להיות כמה אצבעות שנקשרות לDNA במקומות שונים. השיירים שנמצאים על האצבע הם אלו שמבצעים את פעולת הקשירה.

Helix-Turn-Helix - זהו מבנה בחלבון שיכול להקשר לDNA. שני סלילי-אלפא (α helices) המופרדים ע"י רצף קצר של חומצות אמינו.
Helix-Loop-Helix - מבנה שמופיע בד"כ כדימר - שני "מקלות" שנקשרים לDNA משני הצדדים.
Leucine-Zipper - (לאוצין היא חומצת אמינו) - שני "מקלות" הצמודים זה לזה ע"י "ריצ'ראצ'" של לוצינין אחד ליד השני. כל חומצת אמינו שביעית ברצף, בערך, היא לוצין.

Elongation

RNA-פולימראז-2 לפעמים מנסה לשעתק ולא מצליח, ומתחיל שוב את התהליך מההתחלה.
ח. האמינו סרין יכולה לעבור פוספורילציה (יש רק עוד 2 ח. אמינו נוספות שיכולות לעבור פוספורילציה מלבד סרין).
RNA-פולימראז-2 צריך לעבור בקרה כדי לעבור מתהליך הInitiation לElongation, והוא Hypo-phosphoralization. הסרין אצלו, שממוקם בזנב, צריך לעבור זרחון. הפולימראז לא יכול להתחיל להאריך את השרשרת לפני שפקטור נוסף מזרחן את סרין 2. אחרי שסרין 5 וגם 2 מזורחנות, יצירת הmRNA יכולה להתחיל.
הRNA איננו מזורחן כאשר הוא מגיע לפרומוטור.
RNA-פולימראז-2 הראשון שמגיע נקרא Pioneer (חלוץ). אחריו יגיעו פולימראזות אחרים כאשר להם יש כבר Pre-Initiation-Complex מוכן. בסוף הגן, הRNA-פול-2 צריך סימן שיגרום לו לעצור.
mRNA שנוצר עובר עיבוד בקצה 3'של הסיגנל AAUAAA. אחריו יש מרווח של 10-30 נוקליאוטידים ואז רצף של 2 נוק': CA, אח"כ 30 נוקליאוטידים נוספים ואז רצף עשיר ב G או GU.
אנזים שחותך חלק מסויים בשרשרת, מותיר את הmRNA שמתחיל ברצף AAUAAA חשוף. כדי להגל עליו, נוספים לו 250 נוקליאוטידים מסוג A. רצף זה נקרא Poly-A-Tail או זנב פולי-A. על הזנב הזה יושבים החלבונים CstF ו CPSF. כשמגיע הרצף "AAUAAA" זהו סימן שהפולימראז הגיע לקצה הגן, ושני החלבונים האלו מתנתקים מהפולימראז ומתחברים לשרשרת הRNA בקצה ה3' שהופקה ממנו במקום.

כ 15-25 נוקליאוטידים אחרי ה AAUAAA יש חיתוך של ה RNA, והפולימראז נופל מהגן. החיתוך נעשה ע"י CPSF וCSTF.
ה Poly-A-Tail מוסיף את הרצף של 250 נוקליאוטידים מסוג "A" ואח"כ משתחרר. הוא קשור למספר גדול של חלבונים אותם הוא מצפה. חלבון הPABP - Poly-A Binding Protein הוא שנקשר לזנב הPoly-A ומצפה אותו בקצה 3': כך הוא לא יכול להאכל ע"י נוקליאזות. כל mRNA חייב להיות מוגן על-ידיו בקצה 3' שלו.
גם קצה 5' צריך להיות מוגן, וזה נעשה ע"י קבוצה של חלבונים המבצעים mRNA-Capping. הכיפה הזו, הCap, היא נוקליאוטיד ששמו 7-מתיל-גואנזין (m7G), והוא מחובר לmRNA ע"י גשר של 3 פוספטים, שבקצה ה5' שלו הm7G יושב, וכך השרשרת לא יכולה להתארך יותר. הוא מגן על הRNA מפני האקסונוקליאזות שיכולות לבצע Decapping.
הCap גם עוזר לכוון את הריבוזום אל הmRNA.
כל התהליכים האלו מתרחשים במקביל (Splicing, Capping, PolyA וכו').

Splicing

ביצורים אאוקריוטים קיים תהליך הSplicing הייחודי, שבו נחתכים רצפי אאינטרונים, והאקסונים מודבקים זה לזה (האקסונים מהווים את הרצפים המקודדים בגנום) ויוצרים mRNA בוגר. האינטרונים הם רצף אינו מקודד.
יש חלבונים שמזהים את החיבור בין האינטרונים לאקסונים. החיתוך בינהם נוצר במבנה של לולאה. חלבונים נוספים חותכים בקצה 3', וחלבונים אחרים מדביקים את האקסונים מחדש אחד לשני לפי הסדר.

אזור קונצנזוס - האקסונים הם בד"כ חלקים קטנים יותר מהאינטרונים, וניתן לנבא בערך איך יראה הmRNA לאחר הספלייסינג. חלבונים שנקראים ספלייסוזומים, המורכבים בעיקר מsnRNPs - מולקולות של חלבונים וRNA קטן, הם בעיקר אלו שמבצעים את התהליך. הספלייסוזום מורכב בעיקר מu1, u2, u3, u4, u5, u6:
u1 מתלבש בתחילת הרצף. u2 מתלבש על הBranch Point.
חלבוני הu יכולים לזהות אזורים מסויימים לפי רצף הRNA שלהם, שמתחבר לקצה ה5' של האינטרון. u1 יכול לעזוב, וu6 מתחבר במקומו - זהו מבנה דינמי.

Alternative Splicing

מנגנון הAlternative Splicing מאפשר לקבל מאותו גן צורות שונות של RNA. בתא מוח למשל, יתקבל מבנה כלשהו של RNA, ובתא כיליה יתקבל מבנה שונה.
בשני שרירים שונים גם יכולים להתקבל מבנים שונים של mRNA כתוצאה מספלייסינג שונה קצת שמותאם לסוג התא.

mRNA Editing

מצאו שיש תהליכי עריכה במקומות מסויימים- מודיפיקציה מסויימת על נוקליאוטיד בmRNA.

דאמינציה של C (ע"י האנזים דאמינאז) שהופך ל-U. אם יש קודום שמקודד לח. אמינית, הוא יכול לשנות אותו ועל כן יש לכך חשיבות גדולה.
סוג אחר של עריכה, הוא דאמינציה של A, וקבלת נוקליאוטיד חדש במקומו -I=Inozine שנמצא בRNA.
האנזים שקורא את I חושב שהוא G ולכן זה דומה להפיכת A ל-G.
ADAV - שם האנזים שמחליף את A ב-I; הוא מתיישב על הmRNA ומזהה את הA המתאים ומבצע דאמינציה עליו.
חלבון Apolipoprotein-B (בקצרה ApoB) חשוב עבור חומצות שומן. באקסון 26 יש קודון שבmRNA שלו הוא מקודד לח. אמינו גלוטמין בכבד. במעי, לעומת זאת, יש תהליכי editing שבהם דאמינציה של C ונקבל UAA במקום CAA. הרצף UAA הוא סימן לעצירה (Stop-Codon) וכך נקבל במעי הגס חלבון בעל רצף קצר יותר.

תהליך הExport: אחרי שmRNA עובר ביגור ויש לתרגם אותו, הוא יוצא דרך שוער הגרעין ומגיע לציטופלסמה - שם הוא עובר תרגום לחלבון ומתפרק.
הmRNA מצופים בחלבונים הקשורים לספלייסינג וחלקם נושרים בדרך. יש חלבונים שמלווים אותו רק עד הציטופלסמה או רק בחלק מסויים בו נמצא הmRNA.
תהליך השעתוק הוא תהליך של יצור הmRNA, שתפקידו לקשר בין הDNA ליצירת חלבונים.

תרגום - Translation

התרגום מתרחש אך ורק בציטופלסמה. ה-mRNA כבר נוצר. הריבוזום קורא מקצה 5' לכיוון 3' : קודון-קודון.
לכל קודון הוא מביא tRNA, שיש לו 3 אתרים. tRNA יושב בריזובוזום ומביא איתו ח. אמינית. הריבוזום מורכב מ2 חלקים (גדול וקטו).

הקוד הגנטי

Degenerate Code - מצב שבו יש יותר מקודון אחד עבור אותה חומצת אמינו.
קיים רק רצף אחד שמקודד להתחלה: AUG, ולעומת זאת 3 רצפים שמקודדים לסיום (Stop Codons).

ביוכימיה - הרצאה (19.2.08)

שיעור #8

מבנה הDNA הוא מעין צורה שדומה לחרוזים על שרשרת. ה"חרוזים" הם הנוקליאוזום.
חוקרים גילו כי קיים קשר בין כמויות ההיסטונים השונים - יש כמויות כפולות של ההיסטונים H2,H3,H4 יותר מאשר H1.
אורך כל שרשרת כזו הוא כ100 אנגסטרם.
כאשר לקחו DNA ארוז בנוקליאוזום והוסיפו לו נוקליאז (DNAse שחותך DNA דו-גדילי) מצאו שהוא מסוגל לחתוך רק באזורים שבין הנוקליאוזום, וכך קיבלו DNA שהחלקים שאינם חתוכים בו הם ה"חרוזים" - הנוקליאוזומים. כל גודל של ליפוף (גודל של נוקליאוזום) כזה הוא 200bp.
ע"י הוסיפת DNAse לDNA בהדרגה, וראו שלחתיכות הDNA שנוצרו היה קל יותר לנוע בתוך הג'ל, וגודל הקפיצות הוא כ200bp. הסיקו מכך שמבנה הנוקליאוזום הוא של היסטונים וזהו אורכו.
היקף הDNA מסביב ל"חרוז" הוא 145bp והלינקר-DNA הוא באורך של 55bp.

בניסוי נוסף, הוציאו את ההיסטון H1 מכרומטין. כתוצאה מכך השתבש מבנה הנוקליאוזום, והמסקנה הייתה שH1 חיוני למבנה הקומפקטי והתקין של הנוקליאוזום.
DNA ארוז בכרומוזום ומכווץ פי 10,000 יותר מאשר בצורתו הרפויה.
ביצורים פרוקריוטים אין היסטונים מכיוון שאין להם גרעין.
בתאים אאוקריוטים קיימים 3 סוגי RNA-פולימראז (RNA-פולימראז 1, 2 ו- 3).

RNA-פולימראז-1 נמצא בגרעינון ומסנתז rRNA (רנ"א ריבוזומלי). הוא עובד בעיקר על מולקולות rRNA ויש לו פרומוטור אחד. הריבוזום מתרגם את הRNA לחלבון.
18s היא היחידה הקטנה שמרכיבה את הrRNA
28s היא היחידה הגדולה שמרכיבה את הrRNA. מורכב מ2 תת-יחידות נוספות: 5.8s, 5s

באאורקיוטים יש חזרות של גנים, ובהם יש אזורים שמקודדים לrRNA השונים, בינהם יש אזורים פחות חשובים בDNA.
RNA-פולימראז-1 משעתק ממנו Pre-Ribosomal-RNA - Pre-rRNA - 45s.
אנזימי RNAse מבשילים את ה Pre-rRNA ומשאירים ממנו 18s, 28s ו5.8s בוגרים שמרכיבים ביחד ריבוזום.

הrRNA יכול לעבור מודיפיקציות (מתילציות, למשל)
מולקולות Small-RNAs שקשורות לגרעינון משועתקות ע"י פול-,2 מביאות חלבונים לrRNA ומבצעות עליו מתילציה.
ע"י כך הן תורמות לתהליך ההבשלה שלו.
*תזכורת: כדי להגיע למצב ההתחלה (initiation) יש צורך בפקטורי שעתוק - TF
RNA-פולימראז-3 - מתיישב על הפרומוטור שלפני הגן שהוא רוצה לשעתק. לשם כך הוא נעזר בTF (פקטור שעתוק, Transcription Factor) - הפקטורים הם TF3A, TF3B.
RNA-פולימראז-3 גם משעתק את rRNA 5s אשר חלק מצבר מולקולות הrRNA בגרעינון.

שעתוק של 5s rRNA
דרוש גם TF3A בזמן שעתוק של 5s כדי שיוכל לזהות את הפרומוטור. TF3A מתיישב על הגן ונמביא אליו את TF3C, ואז TF3B יכול להגיע לגן. רק אז, האנזים יכול להתחיל בשעתוק.

דרך ל"כיבוי" הגן:
כאשר נוצרות הרבה מולקולות של 5s ויש עודף שלהן, הן מתלפפות עם הTF3A והוא מתלפף ונחסם, ואינו מסוגל להתיישב על הפרומוטור - מה שגורם להפסקה של פעילות הגן.

RNA-פולימראז-2 - אצל אאוקריוטים הפרומוטור גדול בהרבה מאשר אצל פרוקריוטים ומורכב יותר, מכיוון שנקשרים אליו יותר פקטורים.
אזור שנקרא GC BOX קיים הרבה אצל גנים מסוג Housekeeping, שמבוטאים בכל הרקמות בגוף ברצף הבקרה שלהם.
אצל גנים ספציפים לרקמה מסויימת (כמו גן שמייצר גלוקוז שנמצא בכבד) מצאו רצפי TATA Box.

כדי שתהליך הinitiation יצא לפועל, הRNA-פולימראז-2 צריך ליצר קודם קומפלקס שמורכב מ GTF - General Translation Factors או BTF - Basal Translation Factors.
הTATA Box ממוקם Upstream (לפני הגן). TF2D הוא הקומפלקס הראשון שמתיישב על הTATA Box ויש בו מספר חלבונים: TBP - TTA Binding Protein, חלבון שנקשר לTATA Box.
גם TATA Binding Associated Factors שהם קבוצה אחרת של חלבונים (אין צורך בפירוט..)
TF2A מתחבר למולקולה ומחזק את הקשר. TF2B מסמן לRNA-פולימראז-2 את המקום בו הוא צריך להתיישב (לפני הגן).
TF2F מגיע ביחד עם RNA-פולימראז-2 ועוזר לו להתחבר (מושך אותו לפרומוטור).
TF2H-הליקאז פותח את הDNA כדי לאפשר לאנזים להתיישב ב"נוח".
לאחר שכל הפקטורים האלו סיימו את תפקידם, האנזים יכול להתחיל לעבוד.
CTD - C Terminus Domain - הקצה הC של האנזים ארוך כמו זנב וזהו אחד החלקים החשובים אצלו. בגלל שהרבה פקטורים יכולים להקשר אל הזנב הזה, רואים שאי אפשר להתחיל בתהליך השעתוק לפני שהCTD עובר זרחון.

TBP - (מסומן כסליל ירוק במצגת) על הTATA Domain ומקפל את הDNA. כתוצאה מהקיפול, אפשר להביא חלבונים אחרים להתיישב על הDNA. הTBP משמש תמיד כ Pre Initiation Complex גם כאשר אין TATA Box ברצף. גנים עם פחות רצפי TATA מבוטאים בצורה נמוכה.
ידוע היום שכ 2/3 מהגנים לא מכילים רצפי TATA Box. יש אתר אחר שנקרא Initiator, ובכל זאת TBP משתתף.

תאי הגוף שלנו נוצרים מתאי אב (Stem Cells). תא אב מתמיין לתא אב יותר מבוגר.
בתא צעיר (Embrionic Cell) שמו לב שאין ביטוי של β-גלובין (גן שמפיק תאי דם), ולעומתו תא דם אדום כן מבטא β-גלובין. בניסוי שנערך ביטאו קטע DNA בכל אחד מהתאים האלו וגילו שהDNA מתא הדם האדום נחתך בקלות רבה יותר מאשר התא הצעיר.
המסקנה הייתה שיש הבדל באריזת הDNA אצל תא צעיר, שעדיין אין שימוש בגנים שלו לעומת תא דם אדום שאצלו קיימת נגישות גבוהה לDNA-פולימראז-2.
DNA בעל רגישות גבוהה יותר מכונה: "DNA Hyper Sensitive Site".
אצל תא כבד, אזור הβ-גלובין דחוס מכיוון שהוא לא עושה שימוש בגן הזה, לעומת תא אדום שאצלו האזור הזה פתוח.

Chromatine Remodelling - הDNA נפתח ונסגר באזורים מסויימים. זהו נושא חדש שנמצא במחקר. יש אוסף שלם של חלבונים "רעבים" לאנרגיה שמושקעת בפתיחה וסגירה של DNA וחלק גדול מהאנרגיה בתא, הATP משמש לכך.
התהליכים האלו נעזרים בהיסטונים. קצוות ההיסטונים בולטים החוצה, ועליהם מתרחשות מודיפיקציות (למשל: אצטילציה, מתילציה, פוספורילציה, יוביקויטינציה ועוד...) בהתאם לחומצה האמינית, והן גורמות לשינויים במטענים שמכווצים או פותחים את הDNA בהתאמה.
אצטילציה על היסטין 3 יכולה להוביל לפתיחת כרומטין. מתילציה לעומת זאת מביאה לסגירה.

DNA Enchancers & Silencers - במרחק של כ100bp מהפרומוטור, יכולים להשפיע על השעתוק.
אם הDNA מתקפל ומגיע לפרומוטור, פעולת Enhancement נשעית ע"י רצף כזה מחלבון שנקרא Activator שמגביר את פעילות הפולימראז וגורם לו לעבוד מהר יותר.
אם יש צורך להשתיק אזור מסויים, התא משתמש באזור של Silencer שנמצא רחוק יחסית מהגן. גן של רפרסור משפיע על קצב פעילות הפולימראז ומכבה אותו.
Co-Activator - קומפלקס של אקטיבטור.