ביוכימיה - הרצאה (26.2.08)

שיעור #10

תרגום

הריבוזום מתיישב על שרשרת הmRNA ויוצר שרשרת של ח. אמינו - פוליפפטידים. שלושה נוקליאוטידים נקודדים לח. אמינו אחת המתאימה.
בחיידקים הקודים לפעמים שונים מעט מאלו של בני אדם, אך באופן כללי הקוד נשמר במהלך האבולוציה.
הtRNA היא מולקולת RNA שבקצה התחתון שלה יש לולאה ואנטי-קודון שנקשר לmRNA.
הtRNA מביא את החומצה האמינית המתאימה לmRNA.
כדי להתחיל שרשרת פפטיד, יש קוד AUG שמקודד להתחלת התהליך באאוקריוטים. בפרוקריוטים N-Formylmethionine יושב על הtRNA. הפורמיל יורד ורק הח. אמינו מתיונין נשארת. קיים מנגנון שיכול להחליף את המתיונין.

בחיידקים:
ב Lac-Operon יש שלושה גנים. לאחר יצירת mRNA שמכיל את שלושת הגנים, צריך ליצור מהם חלבונים. בLac-Z יש קודון התחלה, וגם בLac-G ובLac-A.
בLac-Z ובLac-G יש רצף AUG. לפני הרצף הזה, קיים רצף עשיר בבסיסי A וG, שנקרא גם Shine Dalgarno Sequence.
שלושה ריבוזומים מתרגמים את הmRNA לפני כל רצף AUG עד אזור הStop Codon.
הStop Codon מפיל את הtRNA ולא מאפשר לו להמשיך - גם הריבוזום נופל.
מאותו הmRNA נוצרים חלבונים שונים.
רצף הShine Dalgarno נמצא כ10 בסיסים upstream ביחס לגן.

תת היחידה בקטנה של הריבוזום, היא הכ16s-Robosomal-RNA. לחלק זה יש רצף ספציפי שקושר את הריבוזום לmRNA ע"י זיהוי של רצף הShine Dalgarno.
בגנים שונים, ה16s יכול להיות שונה כדי להכיר רצפים שונים בmRNA.

tRNA

צורתו של הtRNA היא תלתן. זו מולקולה חד-גדילית שמתקפלת על עצמה ויוצרת מבנה של Stem-loop. אחת הלולאות האלו היא האנטיקודון שמזהה את הקודון על הmRNA.
על מולקולות הtRNA מסתיימות ברצף "CCA" בקצה ה3'.
מבנהו התלת מימדי שמור אך האנטי קודון שונה בהתאם לרצף על הגן. יש כמה נקודות קבועות בtRNA. מולקולה זו עוברת הרבה מודיפיקציות (ביגור) שמשנות את הנוקליאוטידים.
אחת מהן היא פסוידו-יורידין, למשל.
אזור הstem loop, האנטי קודון, הוא האזור היחידי שמכיר את הmRNA.

האנזים אמינו-אציל-tRNA-סינתאז מבצע את תהליך חיבור ח. האמינו לtRNA.
הוא לוקח ח. אמינית ומאקטב אותה ע"י ATP. הATP מתחבר לח. האמינית ונותן אמינו-אציל-אדנילאט. בקשר הפוספט של ATP משתמשים לחיבור ח. אמינית.
הפירופוספט (שתי מוקולות פוספט שמשתחררות) מתפרק לשני פוספטים בודדים ומשחרר הרבה אנרגיה.
הח. האמינית הטעונה יכולה להתחבר לtRNA. בA האחרון של הCCA יש קבוצת הידרוקסיל. הח. אמינית מתחברת לOH ע"י קשר קוולנטי.
המולקולה החדשה היא אמינו-אציל-tRNA. שתיים או שלוש פריים.

האנזים שמלביש את חומצת האמינו סרין על הtRNA יודע לזהות 4 סוגי tRNA (שכל אחד מהן מקודד לסרין).
לא קיים אנזים tRNA-סינתאז עבור N-פורמיל-מתיונין שמצמיד אותו לtRNA אלא חלק מהtRNA עובר התמרה ע"י הוספת פורמיל. חלק מהכרת המולקולה נעשית בזכות ההתמרות.
קיימת גם יכולת בדיקה עצמית של האנזים (Proof Reading) ותיקון במקרה הצורך.
UAC בmRNA מכיר את הGUA בtRNA.
מוטציה יכולה להוביל לשיבושים בתא. לחיידק יש יכולת לדלג מעל קודון בעזרת שימוש במוטציה: במקום GUA הוא יוצר CUA באנטי קודון של הtRNA. אמנם בmRNA יש UAG, אבל הtRNA המתאיםלו גם יביא טירוזין ונקבל מולקולה תקינה.
בדרך זו, על ידי שתי מוטציות בלבד בtRNA, שמביא את הטירוזין לmRNA מקבלים חלבון עם ח. אמינו נכונה בסופו של דבר. תהליך זה נקרא Supressor-Mutation.

אנטי קודון

שני הנוקליאוטידים הראשונים בtRNA חייביים להתאים לנוקליאוטידים בmRNA. במקום השלישי (שנקרא גם "wobble") יכול להופיע U במקום G, למשל, מכיוון שבהרבה מקרים הוא לא משפיע כל עוד שני הנוקליאוטידים הראשונים מתאימים. הסיבה היא, שהרבה חומצות אמינו בעלות שני נוקליאוטידים ראשונים זהים מקודדות לאותה ח. אמינו כאשר לא משנה מה הוא הנוקליאוטיד השלישי .

בפרוקריוטים, תת היחידה הגדולה, 50S, של הריבוזום מורכבת מ23s ו-5s, ו 31 חלבונים בנוסף לכך. החלבונים נקראים L1 עד L31.
תת היחידה הקטנה מורכבת מ 16s, שגם היא מורכבת מתוספת של חלבונים, 21 חלבונים: S1 עד S21.
לתת היחידה הקטנה קוראים 30S.
צפיפות שתי היחידות ביחד היא 70S (היחידות אינן לינאריות, ולכן לא מהוות חיבור של שתי תתי היחידות).

המבנה של הrRNA, הוא חד גדיל של RNA שמקופל בStem Loop. המבנה השלישוני שלו מאפשר לו כניסה לריבוזום ולאתר את רצף הShine Dalgarno הספציפי. צורת הקיפול (המבנה השלישוני) שמורה באבולוציה, למעט יצורים מסויימים שקיפול ה16S שלהם שונה.
23s-RNA הוא גדול יותר ויוצר מבנה מיוחד. ה5s קטן ממנו.
תת היחידה 50s מביאה את הtRNA פנימה, וממנה יוצאת השרשרת הפוליפפטידית.
בחיידקים הmRNA מיוצר ממכיוון 5' ל3', והריבוזום יכול להתיישב על ה5' כך שהתרגום יכול להתבצע במקביל לשעתוק. סינתזת החלבון היא מהקצה הN-טרמינלי לקצה ה C-טרמינלי.
בתוך הריבוזום, הtRNA מתמקם באתר A (נקרא A-Site, או אמינו-אציל-tRNA). לידו יש P-Site
P = Peptidil, ואתר יציאה E-Site, שממנו הtRNA מתנתק ויוצא החוצה.

Initiation
30s ו50s צריכים לתרגם mRNA. ע"י פקטור IF3, שנקשר ל30s, הקשר בינהם מופרד (חייבת להתבצע הפרדה כדי שתהליך התרגום יוכל להתחיל להתבצע).
בשלב הבא (שמתבצע במקביל), צריך להגיע הtRNA-פורמיל-מתיונין (הראשון) לmRNA:
פקטור הבנוי מ IF1 ו- IF2 נקשר לGTP ונושא עימו גם N-פורמיל-מתיונין-tRNA.
הGTP (מולקולה מקבוצת G-Proteins) משחררת אנרגיה ומאפשרת את התהליך.
הקשר בין tRNA לmRNA הוא ללא תלות בתת יחידה הגדולה. נוצר קומפלס לmRNA, tRNA, פקטורי IF1, IF3, ו-50s.
ה IF1 וIF3 מונעים מtRNA אחר לבוא ולהתחבר. כל הקומפלקס הזה נקרא Initiation Complex ומאפשר את התחלת התרגום.
בהמשך, נפרדים IF3 וIF1 ותת היחידה הגדולה 50s מתווספת. GTP משתחרר והופך לGDP שמשנה את מבנה תת היחידה הקטנה, ועכשיו היא יכולה להתחבר לתת היחידה הגדולה, ומתקבל קופלקס חדש - 70s.
הIF2 משתחרר במקביל להגעת ה50s.

תהליך הElongation

בקצה הN-טרמינלי יש N-פורמיל-מיונין. פקטור EF-TU (שמחוברת לו מולקולת GTP, וtRNA מתאים) מביא את הmRNA.
באתר הA-Site הריק, tRNA מתאים מתיישב בפנים בזכות הפקטור EF-TU. בתהליך משתחררת מולקולת GTP והופכת לGDP, ועוזרת לtRNA למצוא את מקומו.
הGTP שהופך לGDP משחרר הרבה אנרגיה, וע"י פקטור נוסף, EF-TS, שגם אליו מחוברת מולקולת GTP, הוא מסלק את הGDP שעל הEF-TU, ומתקבל קומפלקס חדש של EF-TU שמחובר לEF-TS.
ה EF-TS יורד, וה EF-TU נשאר עם מולקולת GTP.
את הח. אמינו שיש לחבר לשרשרת שנוצרה יש להוסיף לקצה הC-טרמינלי של הפפטיד.
הפפטיד "קופץ" מאתר P לאתר A, ומתחבר לחומצת האמינו ע"י פעילות אנזימטית מתוך התת יחידה של הריבוזום (פפטיטין-טראנספראז). קיבלנו פפטיד ארוך יותר בח. אמינו אחת (1+).
בתת היחידה הגדולה שבריבוזום,האנזים שמבצע את הפעילות הכימית הוא RNA (או Rybozime).

ביוכימיה - הרצאה (3.2.08)

שיעור #3

DNA יכול להמצא בצורת ADNA, BDNA ו-ZDNA. מולקולה היברידית (מורכבת מRNA ו-DNA) תהיה בצורת ADNA ותמצא בסביבה מיימית. מבנה של BDNA מתאפשר כאשר החמצן על גבי פחמן 2 חסר. מבנה הZDNA מאופיין ע"י סיבוב הפוך (שמאלי), והפורינים שלו במצב SIN במקום ANTI, מה שמאפשר מתילציה היעילות גדולה יותר. בצורת ה HDNA, ניתן לקבל סליל משולש, או תלת-גדילי. הסיבה לכך ששני הגדילים של הDNA נשארים צמודים זה לזה היא שה-ΔH גדל טובת דנטורציה. ובכל זאת, יש לנו קשרי מימן שתורמים ΔH גדול יותר, מה שגורם ל ΔG להיות חיובי. קשרי המימן הם אלו שמייצבים את המבנה הדו-גדילי בשתי דרכים:

1. העלאת הטמפרטורה תורמת ל ΔG שלילי. היא יכולה לגרום להפרדה בין שני הגדילים, ומתוך כך לדנטורציה.
2. הקטנת החוזק היוני של התמיסה או הוצאת המלח מהתמיסה תתרום לדנטורציה מכיוון שפרמטר הדחייה יגדל.

שכפול DNA

הDNA בגרעין יכול לעבור שכפול ע"י הפרדת הגדילים (הכפלה קונסרטיבית), שעתוק לmRNA, t-RNA או מיקרו-RNA. יצירת המולקולות RNA על בסיס הDNA נקראת שעתוק או תעתוק (Transcription).
מולקולות אלו יוצאות מגרעין התא לציטופלסמה. במהלך השעתוק נוצרות מולקולות RNA, כאשר כיווניות יצירת הRNA היא תמיד מכיוון קצה 5' לכיוון 3' - הנוקליאוטיד החדש תמיד יתווסף בקצה של 3'.

הRNA-פולימראז פותח את הסליל הכפול, וריבונוקליאוטידים מתווספים עד שמולקולות הmRNA והtRNA יורדות. בסוף, מולקולת הmRNA יוצאת לציטופלסמה ומתורגמת לחלבון.
הריבוזום סורק את מולקולת ה mRNA עד שמגיע לקודון ההתחלה "AUG". אז מגיע tRNA עם חומצה אמינית אחרת מתאימה לבניית החלבון. החלבון תמיד נוצר מהקצה הN-טרמינלי לכיוון הקצה הC-טרמינלי.

תהליך שכפול הDNA קורה ב-3 שלבים עיקריים:

• התחלה (Initiation)
• שכפול (Chain elongation)
• סיום (Termination)

שכיחות המוטציות בתהליך השכפול נמוכה מאוד - קיים מנגנון המונע זאת. ישנה מוטציה "שקטה", אך מוטציה יכולה גם להיות מסוכנת ולשנות פעולה של חלבון בכמה דרכים. קיימת גם מוטצה טובה, חיובית שמקנה לאורגניזם יתרון - זו אחת התיאוריות של האבולוציה.
מערכות הדם, המין (אצל הזכר) והעור משכפלות תאים. התא צריך לדעת לסנכרן בין שכפול התא לבין שכפול הDNA.

מחקר שנערך על חיידק ה E-Coli בוצע על מנת להבין כיצד מתבצע התהליך.

• קצב השכפול הוא 850 נוקליאוטידים לשניה. אצל יונקים הקצב הוא 60-90 נוקליאוטידים לשניה.
• בDNA של חיידקים (DNA מעגלי) השכפול מתחיל מנקודה אחת. אצל בני אדם (DNA לינארי) יש עשרות עד מאות Origin of Replication, והשכפול מתבצע בו-זמנית מכמה נקודות.
• מחזור חלוקה של חיידק הוא כ-20 דקות, ומחזור שכפול DNA הוא כ-40 דקות.

השכפול מתחיל ע"י הפרדה בין 2 הגדילים, שיוצרת מזלג הכפלה.
בהנחה שהשכפול מתבצע בכל גדיל בו-זמנית, הכיוונים הפוכים.
לקחו DNA מעגלי (הנמצא בחיידקים, וירוסים ובקטריופאג'ים) בזמן ההכפלה ובדקו את זמן ההתחלה והסיום של התהליך. לקראת סיום ההכפלה, הוסיפו למצע החיידקים נוקליאוטידים המסומנים בטרידיום (איזוטופ של מימן, H). אם ההוספה הייתה לקראת סיום ההכפלה ומעט לפני הכפלה חדשה, היה מתקבל אזור יחיד מסומן בDNA. אם ההכפלה היית ל-2 כיוונים היינו מקבלים 2 סימונים רדיואקטיביים.
ניסוי דומה נעשה על חיידק עם פלסמיד (DNA חוץ מעגלי, שאינו חלק מהגנום הכרומוזומלי של החיידק).
פלסמיד יכול לעבור אינטגרציה לתוך DNA הכרומוזומלי של האורגניזם, וכך להיות מוכפל ביחד עם הDNA המקורי, ואף להשתלב לצמיתות בDNA המקורי. פלסמיד שעבר אינטגרציה כזו נקרא אפיזום.
לפלסמיד יש Origin of Replication משל עצמו. קיים מנגנון שבו הOOR של האפיזום מושתק, והOOR של החיידק הוא זה שממנו מתחילה ההכפלה.
הOOR הוא תלוי רצף. ישנם רצפים מסויימים שאם נכניס אותם לתוך הDNA הם יתחילו מאותו OOR. רצף זה צריך להיות מוכר ע"י חלבונים ספציפיים.
בהרבה יצורים הצליחו לאפיין את הרצף ע"י הוצאת מקטע מתוך הרצף, וכתצאה מכך הOOR השתנה.
רצף הOOR מוכר ע"י חלבונים - הם נקשרים אליו ומגייסים את שאר החלבונים לתהליך השכפול.
בזמן החלוקה, הDNA כבר נמצא באמצע תהליך ההכפלה של המחזור הבא.
כאשר שני הגדילים פתוחים, מתחיל תהליך השכפול מכיוון 5' לכיוון 3' בגדיל המוביל (Leading Strand). בגדיל המשלים (Lagging Strand) יש שימוש במקטעי אוקזקי - הגדיל מייצר מקטע קצר בכל פעם.

האנזים DNA-פולימראז מאריך שרשרת קיימת של DNA. לשם כך, יש צורך באנזים נוסף, פרימאז (Primase), שמייצר פריימר מסוג RNA.
ב Lagging Strand נעשה שימוש בהרבה פריימרים, בכל פעם באזור ה5' של מקטעי האוקזקי. לכן, האנזים שפותח את הסליל, הליקאז (Helicase) צמוד לפרימאז.
פרימוזום (Primosome) הוא קומפלקס של פרימאז והליקאז.
על כל גדיל של DNA יש DNA-פולימראז. שני האנזימים האלו (אחד על כל גדיל) מחוברים גם הם בקומפלקס אחד, ולמרות שכל אחד מהם משכפל לכיוון נגדי, הם נעים לאותו כיוון של מזלג ההכפלה כדי שיוכלו לשכפל את שני הגדילים בקצב אחיד.

SSDBP - Single-Stranded DNA Binding Proteins

אחרי שאנזימי ההליקאז פתחו את הDNA, יש שני גדילים "עצמאיים". כדי למנוע את הצמדות הגדילים מחדש, צריך לייצב את המבנה החד-גדילי, ולאפשר קשרי מימן בין הנוקליאוטידים החדשים.
השכפול תמיד מתבצע מכיוון 5' ל3'. נוקליאוטיד חדש תמיד מגיע כ- טרינוקליאוטיד המתווסף לקצה 3'.
ה α-פוספט הוא הפוספט שקשור לקצה 5 של הסוכר.
בקצה ה3' יש קבוצת OH פנויה. אם אין כזו קבוצה פנויה, אי אפשר להאריך את השרשרת, כי כאשר נוקליאוטיד חדש מגיע עם GTP, הG מזהה את הC בעזרת SSDBP, ולאחר הזיהוי יש התקפה נוקליאופילית על הפוספט, והוא מוותר על האלקטרונים של הקשר, ויוצר קשר בין שני הנוקליאוטידים ע"י שחרור הדיפוספט, כך שקיבלנו תוספת נוקליאוטיד לשרשרת עם קבוצת OH פנויה נוספת.

לגבי ה Lagging Strand: הבעיה היא שצריך לסלק פריימרים של RNA. לאחר מכן, צריך להשלים את הפער עם דיאוקסינוקליאוטידים ולסגור את המולקולה.

שלושת האנזימים העיקריים בתהליך הם:
DNA-פולימראז-1: מקודד ע"י הגן פול-A
DNA-פולימראז-2: מקודד ע"י הגן פול-P
DNA-פולימראז-3: מקודד ע"י הגן פול-C

Processivity - מושג שמייצג את מספר הנוקליאוטידים שהאנזים יכול להוסיף למולקולה לפני שהוא נופל ממנו (או לפני שהוא מאבד את יכולת הפעולה שלו).
DNA-פולימראז-3 הוא האנזים בעל קצב העבודה הגבוהה ביותר מבין השלושה, ואצל חיידקים הוא מבצע את כל עבודת השכפול.
DNA-פולימראז-1 ממלא את הרווחים (Gaps) במקום הפריימרים של הRNA.
יש לו 3 פעולות שונות:

1. פעילות של DNA-פולימראז - הלבשת קצה על שרשרת DNA.
2. פעילות של 3'-אקסונוקליאז - בדיקה שהוכנס הנוקליאוטיד המתאים. אם הוכנס נוקליאוטיד שגוי, האנזים יחתוך אותו ויכניס נוקליאוטיד נכון במקומו. זהו מנגנון נגד מוטציות.
3. פעילות 5'-אקסונוקליאז - פעילות של חיתוך מולקולות מקצה ה5' של המולקולה.

בין שני מקטעי אוקזקי, יש אזור קצר בו הDNA לא מחובר. בנקודה זו נכנס הDNA-פולימראז-1 לפעולה: הוא מוריד את הנוקליאוטיד הראשון בפריימר של ה-RNA - הורדה של נוקליאוטיד מקצה 5', והוספת נוקליאוטיד לקצה 3'.

OOR* = Origin of Replication