ביוטכנולוגיה (שנה ב')

ביוכימיה – הרצאה (30.3.08)

2008-04-07T13:59:00.000-07:00

שיעור #18

K_cat – The turnover number

חלק 1: משמעות הקינטיקה האנזימטית

חלק 2: סוגים שונים של מעכבים

K_cat הוא מדד לפעילות הקטליטית של האנזים, והוא גם מודד את הסיבובים (או מס' המחזורים של האנזים). במילים אחרות, זהו מס' מולקולות הסובסטרט שנהפכות על ידי האנזים לתוצר ליחידת זמן.

ככל שהK_cat גבוה יותר, האנזים פעיל יותר, והוא נמדד כ Sec/-1.

K_cat יכול להיות 1, 0.5 או אפילו מיליונים לשניה.

הK2 מוגדר כשלב המגביל. לכל שלב שנוסף יש K משלו, ולרוב יש כנראה לפחות שלב אחת שמגביל את התגובה (צוואר בקבוק).

הK_cat הוא מדד לכל השלבים שאם לא עוברים אותם (והם מעכבים את התפתחות התגובה) התגובה לא תתרחש, או שהיא תתרחש באיטיות רבה.

כשבודקים קינטיקה צריך רק לבדוק את ערכו של Kcat.

K_cat במקרה של מיכאליס-מנטן הוא K2.

1. K_cat הוא מדד לכושר הקטליטי של האנזים.

2. מס' המולקולות במולים של הסובסטרט שעוברות שינוי למול של אנזים לשניה.

3. - מס' המחזוריםturnover-number. המס' יכול לנוע מ40 מיליון פעולות לשניה (עבור קטלאז) ועד ל0.5 פעולות לשניה (עבור ליזוזום).

אפשר להשתמש ביחס בין K_cat לkm כדי להגדיר את יעילות האנזים.

אם הk_cat נמוך מאוד, יקח הרבה זמן להפוך את הסובסטראט לתוצר. לכן, אפשר להשוות בין אנזימים שונים לפי היחס בין K_cat ל Km שמהווה את היעילות הקטליטית.

לכל אנזים יש Km וk_cat מסויים עבור פעילות קטליטית כלשהי. ככל שהיחס גדול יותר, האנזים יעיל יותר ונותן יותר תוצרים עבור אותה יחידת זמן.

גרף של V כפונקציה של ריכוז הסובסטראט עבור שני אנזימים: אם מכפילים את ריכוז האנזים פי 2, גם מהירות הריאקציה תגדל פי 2.

יש אנזימים שצריכים 2 סובסטראטים כדי לפעול. הפעילות שלהם נקראת Random כי הם מסוגלים לקשור סובסטראט א' או ב'. הקשירה מתבצעת בצורה אקראית. יש גם פעילות קישור מסודרת – עד שאנזים לא קושר סובסטראט א', הוא לא יוכל לקשור את סובסטראט ב'.

פעילות פינג-פונג

זוהי פעילות שבה יש כמה מצבים שבהם האנזים יכול להמצא. מצב ברירת המחדל הוא הE. תוך כדי שהאנזים קושר את הסובסטראט, חלק מS1 הופך לP1. P1 משתחרר, אבל שארית מS1 עדיין קשורה לאנזים והוא נמצא במצב ביניים שנקרא E'. הסובסטראט השני נקשר, התגובה האנזימטית מתבצעת וS2 הופך לP2. בסוף התהליך האנזים נשאר E (לא עובר שינוי אבל במצב הביניים, באמצע התגובה, האנזים הופך לE' כי הוא קשר משהו.

כימוטריפסין עובד לפי מנגנון פינג-פונג: האנזים מנתק את הקשר הפפטידי באתר הפעיל, והחלק הN-טרמינלי עדיין קשור לאנזים. כדי לשחרר את החלק הקשור צריך מים. מים הם הסובסטראט השני שמסוגל לשחרר את השרשרת.

מעכבים

חומרים שמעכבים פעילות אנזימטית – מתחלקים ל2 קבוצות.

1) מעכבים הפיכים

2) מעכבים בלתי הפיכים

למעכבים הפיכים יש לרוב קישור לא קוולנטי של הקישור לאנזים. במצב של מעכב בלתי הפיך יש לרוב קישור קוולנטי של המעכב לאנזים.

מעכבים בלתי הפיכים הם הרבה פעמים רעלנים שמשבשים את פעילות האנזים.

מעכבים הפיכים

מסוגלים לעכב את הפעילות האנזימטית, אבל כאשר מסלקים את המעכב, מחזירים את הפעילות האנזימטית לקודמה.

אפשר להפריד מעכב הפיך מאנזים בעזרת דיאליזה – המעכב יעבור דילול והאנזים לא יעבור דיפוזיה (הוא ישאר בשקית). כשהמעכב מסולק מהתמיסה, האנזים ימשיך לפעול כרגיל.

Ki – קבוע העיכוב.

ישנן 2 קבוצות עיקריות של מעכבים (כולם הפיכים), וקבוצה שלישית תיאורטית:

1. מעכב תחרותי

2. מעכב לא תחרותי

3. מעכב בלתי-תחרותי – לרוב מקרה שלא קיים באמת.

מעכב תחרותי נקשר לאתר הפעיל של האנזים כי הוא דומה לסובסטראט. יש לו אפיניות גבוהה לאתר הפעיל ביחס לסובסטראט.

האנזים יכול להקשר או לסובסטראט או למעכב. אם נוצר קומפלקס EI, לא קורה כלום. ככל שמגדילים את ריכוז הסובסטראט, המעכב ישפיע פחות, כי יש יותר סובסטראט מאשר מעכב, ויש יותר סיכוי שאנזים יקשר לסובסטראט.

המעכב מפריע לפעילות הקטליטית (לא נותן לסובסטראט להפוך לתוצר) לכן צריך יותר סובסטראט כדי לקבל את אותה כמות תוצרים (או אותה מהירות), לכן צריך להעלות את הkm.

כאשר משווים בין שני גרפים – אחד עם מעכב והשני בלי מעכב, שניהם יגיעו בסופו של דבר לאותו Vmax, אבל במקרה שיש מעכב נוסיף יותר סובסטראט כדי להגיע לvmax.

מעכב לא-תחרותי

זהו מעכב שלא נקשר לאותו אתר פעיל כמו הסובסטראט (הוא נקשר באתר אחר על גבי האנזים).

מעכב לא תחרותי פוגע בפעילות האנזים (לא פוגע בקישור לסובסטראט).

האפיניות של האנזים לסובסטראט לא משתנה כתוצאה מהקישור של האנזים למעכב, ולכן Km נשאר קבוע. Vmax הוא זה שיורד.

בסופו של דבר המעכב מוריד את יעילות האנזים. הkm לא משתנה.

סוג נוסף של מעכבים הפיכים (לא נדבר על המשוואות שלהם) הוא מעכב מעורב – Mixed Inhibitor. אותו מעכב מסוגל להשפיע על Vmax וגם על Km.

אף אחד מהחיתוכים של הגרפים לא נשאר קבוע.

אפשר להשתמש במעכבים כתרופה – לדוגמא ריטונביר – ritonavir. זו תרופה שמבוססת על פפטיד, שדומה לאזור הפפטידי שהפרוטיאז שוירוס הHIV מזהה, והוא הכרחי לקיפול של הוירוס ולפעילות של הוירוס.

סונתז מעכב שדומה לאתר שמזוהה על ידי הפרוטיאז. בחלק מהזמן, האנזים של הוירוס נקשר למעכב במקום לתאים.

מעכבים בלתי-הפיכים

יש בהתחלה שיווי משקל בין המעכב לאנזים. בשלב כלשהו, המעכב תוקף את האנזים וגורם לאינאקטיבציה של האנזים על ידי קשירה קוולנטית באחד האתרים שלו (לא בהכרח באתר הפעיל). אין אפשרות להחזיר את הפעילות האנזימטית לקדמותה לאחר שהמעכב מסולק.

המעכב יכול להקשר לאנזים גם כאשר קשור לו סובסטראט. שלב זה יכול להיות הפיך, אבל אחרי זמן מסויים המעכב תוקף את האנזים, ונקשר קוולנטית.

לקבוע התגובה קוראים Kinact.

בסוף נקבל קומפלקס אנזים-מעכב הקשורים בקשר קוולנטי שלא ניתן להפריד בינהם. משוואות התהליך מסובכות מאוד.

פנאצילין הוא בלתי הפיך – הוא מעכב אנזימים שמעורבים בסינתזה של דופן החיידק.

ביוכימיה – הרצאה (25.3.08)

2008-04-07T13:51:00.000-07:00

שיעור #17

טריוז-פוספט-איזומראז – אנזים שחשוב בגליקוליזה. יש 3 חומרים שנוצרים: גליקופוספט, סיסנדיול והתוצר הסופי: דיהידרוקסי אצטון פוספט.

המבנה הרבעוני שלו הוא 2 תת יחידות זהות. יש ח. אמינו באתר הפעיל: גלוטומאט 165, היסטדין 95 שיש להן תפקיד חשוב בהפיכת G3P ל DHAP.

יש מכסה שמכסה את הסובסטראט, ותפקידו לייצב את מצב הביניים. אם נפגע במכסה הזה, נוריד את יעילות התגובה האנזימטית. המכסה הוא חלק מהחלבון ומייצב את ה C-CENDIOL למרות שהוא לא חלק מהאתר הפעיל.

האנזים פוגש את הG3P וקושר אותו. אחרי זה יש הפיכה ל C-CENDIOL שקשור לאנזים, והוא הופך לDHAP ולבסוף הDHAP משתחרר.

האננדיול נוצר על ידי העברת הפרוטון של הG3P שהופך לOH. הפרוטון "נגנב" על ידי הגלוטומאט.

הקשר הכפול בין C לC נפתח ומתקבל DHAP. האנזים חוזר למצבו ההתחלתי ויכול לקטלז תגובה נוספת – הוא לא עובר שינוי תמידי.

מצבי הביניים הם בעלי אנרגיה חופשית נמוכה. תגובה כזו יכלה להתרחש ללא אנזים, כשנוסיף אנזים למערכת הוא ייצב את מצבי הביניים; האנרגיה החופשית יורדת כל הזמן.

סרין פרוטיאזות

זו משפחה גדולה של חלבונים עם 3 נציגים:

כימוטריפסין ואלסטאז. הם מסונתזים לרוב בבלוטת הלבלב וחשובים לפירוק חלבונים במעיים (מפרקים את הקשר הפפטידי). לכולם יש אספרטאט (חומצה אספרטית), היסטדין וסרין.

בקיפול החלבון, חומצות אמינו שרחוקות במבנה הראשוני יכולות להיות קרובות יותר במבנה השניוני.

בפרוטיאזות האלו יש כיס, POCKET, שנמצא תמיד קרוב לסרין. הכיס הוא אזור מוגן בחלבון והאופי שלו שונה בין סרין-פרוטיאזות שונות. בכימוטריפסין רואים שהכיס הזה הוא מאוד הידרופובי, והוא ירצה למשוך אליו אזור הידרופובי אחר.

בטריפסין יש מטען שלילי בתוך הכיס, והוא ירצה למשוך מטען חיובי, למשל ארגנין, ליזין...

אפשר להגדיר 6 שלבים של התגובה הקטליטית של כימוטריפסין:

1. קישור של השרשרת הפוליפפטידית שיש לפרק.

2. הפרוטון של הOH מקבוצת ההידרוקסיל מסוגל לעבור מסרין להיסטדין, כך שההיסטדין יהיה טעון חיובי. נוצר מצב של חמצן עם קשר אחד פתוח – לכן הוא יתפוס את הפחמן שהוא חלק מהקשר הפפטידי של האתר.

3. הפחמן של הקשר הפפטידי (בין C לN) עוזב את החנקן לטובת הסרין ונוצרו 2 שרשראות פוליפפטידיות במקום אחת שהייתה בהתחלה.

4. ההיסטדין פנוי, והוא תופס מולקולת מים.

5. המים מתפרקים כאשר ההיסטדין גונב פרוטון מהמים, והOH מתקשר בחזרה לחלק הN-טרמינלי של החלבון שקשור לחמצן.

6. הקשר בין הפחמן לחמצן מתנתק, ונשאר לסרין לקחת פרוטון מההיסטדין, והוא חוזר להיות OH.

מבחינה כימית, יש צורך במים כאשר חלבון מתפרק. לכן מים הם גורם חשוב בהידרוליזה של חלבון.

בשני החלבונים יש היסטדין, וגם חומצה אמינית חומצית.

היסטדין היא ח. אמינו חשובה כי הPKA שלה קרוב לPH הפיזיולוגי, ולכן יש הרבה פעמים היסטדין במולקולות בעלות פעילות אנזימטית.

קינטיקה של אנזימים

ניתן לעקוב אחרי פעילות האנזים על ידי הסתכלות על קצב הופעת התוצר או קצב העלמות הסובסטראט.

מהירות הריאקציה יורדת עם הזמן (קצב יצירת התוצר לאחר זמן מסויים הולך ודועך). ריכוז הסובסטראט הולך ויורד עם הזמן.

יש מעכבים שיכולים להיווצר במהלך האקטיבציה שמורידים את קצב התגובה.

הקינטיקה של האנזימים יכולה לעזור לנו להבין איך האנזים מתנהג בהשפעות שונות, למשל כתלות בPH, בריכוז האנזים עצמו, בטמפרטורות שונות וכתלות במעכבים.

מודל מיכאליס-מנטן (יהיה במבחן!)

מיכאליס ומנדל ניסו לבנות מודל שמתאים לקינטיקה של אנזימים, והם הניחו את ההנחות הבאות:

1) בתהליך יש יצירה של קומפלקס אנזים-סובסטראט.

2) מגיעים למצב STEADY-STATE מהר מאוד (שהES קבוע)

3) הקישור של התוצר לאנזים וחזרה לES הוא שלב זניח.

מודל המצב העמיד

K1 וK-1 הם קבוע המהירות לכל כיוון.

K2 הוא קבוע התגובה שבה אנזים+סובסטראט (מצב מגביל) הופך לתוצר ואנזים.

ניתן לכתוב את מהירות התגובה:

V=K₂[ES]

[E]_t = [ES] + [E] [E]_t כמות האנזים הכללית

[E] = [E]_t – [ES]

K₁[E][S] = ES קצב יצירת

K_-1[ES] + K₂[ES] = ES קצב פירוק

K₁[E][S] = K_-1[ES] + K₂[ES]

[ES] = [E]_t[S]

----------------------

K₂+K_-1 + [S]

-----------

K₁

Km = K₂ + K_-1

-----------

K₁

V_max --> קצב התגובה המקסימלי

V_max = K₂[E]_t

V = V_max[S]

--------------

K_m + [S]

Km - קבוע מיכאליס, מסמל את הריכוז שבו Vmax הוא חצי.

אם S=Km, V=1/2 Vmax.

קבוע מיכאליס מאפיין את התגובה האנזימטית בין אנזים מסויים לסובסטראט נתון.

אפשר להתייחס לkm כמדד לאפיניות של האנזים לסובטראט.

Vmax הוא ערך תיאורטי – אף פעם אי אפשר להגיע אליו.

שני מדענים, הגיעו למשוואה (כמה שנים מאוחר יותר) שמגדירה את Vmax.

משוואת Lineweaver-Burk

1/V = Km/Vmax x 1/[S] + 1/Vmax

ביוכימיה – הרצאה (18.3.08)

2008-04-07T13:33:00.000-07:00

שיעור #16

סיכום עד עכשיו:

בריאות הלחץ החלקי קבוע, ומעודד קישור של חמצן להמוגלובין. זה גם מתנגד לאפקטים אלוסטרים אחרים שגורמים להמוגלובין להתחמצן.

כאשר ההמוגלובין במצב OXY נכנס לרקמות החמצן משתחרר, אבל נכוחות של CO2 מעודדת אפקט בור, וגם יצירת קרבמאט שמעודד שחרור חמצן.

הBPG עוזר לשחרור החמצן כי הוא מעודד מצב DEOXY. המוגלובין מסוגל לקשור CO2 בעיקר במצב DEOXY.

הDEOXY-המוגלובין חוזר לריאות ששם הPH גבוה יותר (אפקט בור הפוך) ששם יש CO2 נמוך יותר. הCO2 עובר בדיפוזיה ומשתחרר בריאות.

אנמיה חרמשית נפוצה יותר באיזורים חמים (סאבטרופיקליים). הסיבה לכך היא מלאריה.

מה גורם לאנמיה חרמשית? (Sickle Cell)

במוטציה יש שינוי ברצף הDNA. יש כמה סוגי מוטציות:

Missense Mutation – החלפה של בסיס בDNA על ידי בסיס אחר. באנמיה חרמשית זה המקרה. A הופך לT וחומצה גלוטמינית הופכת לואלין. שינוי אחד גורם למחלה הזו.

Nonesense Mutation – החלפת הבסיס גורמת לSTOP-CODON וקוטעת את רצף החומצות אמינו.

Frameshift – הפרעה למסגרת הקריאה.

Deletion Mutation – מחיקה של בסיס שגורמת להזזת מסגרת הקריאה, מה שגורם ברוב המקרים לשינוי טוטלי של החלבון.

הפיכה של גלוטמין לואלין, גורם לחומצה אמינית הידרופובית שמופיע על פני השטח של החלבון. נוצרת תגובת שרשרת – הידרופובי פוגש הידרופובי, ויש שקיעה של ההמוגלובין בתוך תא הדם האדום. השיקוע הזה משנה את הצורה החרמשית של התא וגורם לליזיס של התא, מה שמוביל לפחות תאי דם פעילים שיכולים לשאת חמצן.

רוב ההמוגלובינים המוטנטים (כ95%) הם החלפה של חומצה אמינית אחת בלבד. יש מוטנטים שלא משנים כלום ויש כאלו שיכולים לגרום למחלות קשות. סוג מסויים של מחלות נקרא "טלסמיה" – מחלה שמתבטאת במחסור של שרשרת אחת של המוגלובין. טלסמיה יכולה להגרם ממחיקת גן או FRAMESHIFT MUTATION.

בטא-טלסמיה היא מחלה קשה (קטלנית), אך פחות קשה אם מדובר במצב הטרוזיגוטי. אם רק גן אחד נמחק, האדם יוכל להסתדר עם ההעתק היחיד של הבטא.

אלפא-אלסמיה היא מחלה פחות קשה מבטא-טלסמיה, כי יש לנו 2 גנים לאלפא (אלפא-1 ואלפא-2): מקבלים 2 מכל הורה, וסה"כ יש 2 אלפא-2 ושני אלפא-1. אם חסרות 3 שרשראות או 4, המצב קשה מאוד...

נוגדנים

נוגדנים הם חלבונים גלובולריים. המשותף להם ולהמוגלובין הוא ששניהם קושרים משהו (נוגדנים קושרים אנטיגנים, והמוגלובין קושר חמצן). אפשר לחלק אותם ל5 משפחות: IGA, IGE, IGD, IGM, IGG.

IGG – IMUNOGLOBIN. המבנה הרבעוני שלהם מורכב מ4 שרשראות – 2 כבדות ו2 קלות. השרשראות קשורות בינהם על ידי קשר דיסולפידי. החלק שנקשר להאנטיגן (החיידק או הוירוס) נקרא FAB. החלק שלא נקשר לחיידק נקרא FC.

שני הFABים יכולים להקשר ל2 אנטיגנים בו זמנית (2 אתרי קישור בנוגדן אחד). הציר בינהם (הHINGE) הוא חלק מהשרשרת הכבדה.

המולקולות האלו נקראות גם Antigenic Determinant. אנטיגן מוגדר כחומר שמסוגל לעורר תגובה של מערכת החיסון. זה יכול להיות גם וירוס, בקטריה או חלבון קטן. נוגדנים יכולים להקשר בצורה מאוד ספציפית לאנטיגנים. לא כל האנטיגן מסוגל להקשר לאנטיגן – יש אזורים מיוחדים שנקראים Antigenic Determinant שאליהם נקשרים נוגדנים באפיניות גבוהה. כשמסתכלים על נוגדן, שתי הזרועות שלו קושרות את אותו אנטיגן. הנוגדן יכול לגרום בצורה כזו לשקיעה וסילוק של האנטיגן (כאשר הם מחוברים ביחד).

כאשר נוצר קומפלקס גדול של נוגדנים שנקשרו לאנטיגנים, מערכת החיסון מבינה שיש בעייה ומסלקת את הקומפלקס.

תאי הB ממשפחת הלימפוציטים הם שמייצרים את הנוגדנים. לחלק מהם (EFFECTOR CELLS, PLASMA CELLS) יש תפקיד של ייצור אנטיגן בלבד – וחלק יכולים לשמש כתאי זיכרון חיסוניים, MEMORY CELLS, למקרה שהגוף יפגוש באנטיגן בעתיד.

יצירת נוגדנים היא תגובה "הומורלית". זהו מונח שמקביל לתגובה תאית (Cellular Response). התגובה התאית מתווכת על ידי סוגים אחרים של תאים, שהמוכרים בינהם הם הלימפוציטים T. אם הנוגדנים מסתובבים בחופשיות בדם וצריכים לקשור אנטיגנים, התגובה התאית היא יותר דינמית וחכמה: היא עושה שימוש בתקשורת בין תאים.

דוגמא: סרטן מתפתח בגוף שלנו (לא ממקור חיצוני) ותא סרטני יכול לפלוש להרבה מקומות בגוף ולא תמיד נראה הבדל כי הוא חלק מתאי הגוף. מה שמשתנה בתא הסרטני הוא דגם ייצור החלבונים. אם תא רגיל מייצר חלבונים מסויימים בכמויות מסויימות, התא הסרטני ייצר חלבונים אלו בכמויות אחרות. תאי T מסוגלים "לבקש" מהתא הסרטני תעודת זהות. אם הם מזהים תא חולה או מודבר בוירוס, הם מחוררים את התא על ידי כדורים (פרפורין).

תעודת הזהות של התא נקראת MHC. צורתו כמגש שמופיע על פני השטח של כל התאים שלנו בגוף חוץ מתאי דם אדומים. על החלבון MHC יש פפטיד בגודל של כ9 חומצות אמינו שמקורו מחלבון תוך-תאי. החלבון התוך-תאי יכול להיות חלבון שמתבטא יותר (כמו במקרה של תא סרטני). דגם החלבונים בתא סרטני משתנה, והפפטידים שנגזרים מהחלבונים של התא מופיעים בצורה שונה על פני התא. תא הT מגיע ונקשר לMHC על ידי T-Cell Receptor (לכל תא T בגוף יש כזה). אם הפפטיד רגיל, תא הT עוזב. אם הפפטיד סרטני, תא הT תוקף את אותו תא.

ה T-Cell Receptor דומה לחלבוני IGG באזורים מסויימים: יש להם צורת קיפול שנקראת Imunoglobin Fold (קיפול אימונוגלובוליני) שמבוסס על 2 משטחי בטא אחד מול השני (אנטי-פרלל).

אנזימים (החומר נמצא בפרק 11 בספר)

אנזים הוא חומר שמשמש כקטליזטור (זרז) של תגובה כימית – בד"כ נמצא בתאים חיים. סוג אחר של זרזים נקרא Rybozimes שפועלים בדומה לאנזימים.

זרז גורם להאצה של תגובה כימית מבלי שהוא בעצמו עובר שינוי. רוב הזרזים הביולוגיים הם אנזימים. אנזים פועל על מצע (סובסטראט). אנזימים מסוגלים להאיץ ריאקציה בכמה סדרי גודל – פי 100, פי 1000 ואפילו פי מיליארד!

האנזים אינו משתנה, ולכן יכול להשתתף בתגובות נוספות. ריכוז קטן של אנזים יכול להיות בעל השפעה גדולה מאוד על תגובה כימית.

אנזים לא משנה את שיווי המשקל של התגובה הכימית – הוא מזרז אותה, אך שיווי המשקל נשאר אותו הדבר.

בתגובת פירוק של מיי חמצן H₂O₂:

אם נוסיף יון ברזל, הוא יזרז את התגובה פי 1000. אם נוסיף אנזים קטלז, הפירוק יהיה מהיר פי מיליארד!

דוגמא נוספת ליעילות אנזימים: פפטיד קטן שיכול להיות מפורק על ידי פפסין בתוך כשעה. ללא אנזים, הפירוק יקח חודשים.

כל תגובה כימית צריכה לעבור מחסום אנרגיה כדי שתצא לפועל (דלתא G צריך להיות שלילי). האנזים מוריד את אנרגיית האקטיבציה של תגובה כימית. בגלל שמדובר בתגובה כימית, גורמים כמו PH וטמפרטורה משפיעים: חימום יכול לעזור עד לנקודה אופטימלית שבה האנזים עובד בשיא היעילות. אם נחמם יותר מנקודה זו היעילות תרד בגלל דנטורציה. שיווי המשקל לא משתנה – הכל קורה אותו הדבר רק יותר מהר.

לכל אנזים יש PH אופטימלי. אנזימים מסוגלים להבדיל בין איזומרים אופטיים, לדוגמא, בין ח. אמינו L או D.

מצב מעבר ומצב ביניים

הרבה אנזימים מסוגלים לפעול על ידי כך שהם משנים את הסובסטרט למשהו שנמצא במצב ביניים. מצב הביניים הוא בעל אנרגייה חופשית נמוכה (לא נמוכה כמו התוצר, ויותר נמוכה מהסובסטרט). במצב ביניים האנרגייה החופשית נמוכה.

האנזים מפרק את הגבעות לשני חלקים (בגרף במצגת) ואז יותר קל לו לעלות ולרדת.

פעילות האנזים חשובה בכך שהוא מסוגל לתווך יצירה של חומר במצב ביניים שהאנרגייה החופשית שלו נמוכה יחסית.

האתר הפעיל (איך אנזים עובד?)

הסובסטרט מתאים בדיוק לאתר הפעיל (המקום בו מקוטלזת התגובה הכימית) של האנזים. זהו מודל ישן ולא מדוייק.

תיאורית ההתאמה המישורית (Induced fit model)

הסובסטרט והאנזים מתאימים את עצמם אחד לשני. האנזים מצוי במצב שאינו נצאים בדיוק לסובסטרט. כאשר הסובסטרט נקשר לאנזים הוא משנה את צורת האנזים. שינוי בקונפורמציה גורם להתחברות הנכונה של אתרים פעילים בתוך האנזים, מה שמעודד תגובה אנזימטית. כאשר התוצר משתחרר האנזים חוזר לצורתו המקורית.

אקסוקינאז – אנזים שהופך גלוקוז לגלוקוז-6-פוספט (שלב מס' 1 בגליקוליזה). הסובסטרט שנכנס לאקסוקינאז משנה את צורתו כדי להתאים עצמו.

הפעלת אנזים לא פעיל (זימוגן) על ידי חיתוך קשר פפטידי ספציפי.

יש חלבונים שצריכים לעבור שפעול. השפעול נגרם על ידי הידרוליזה של קשרים בחלבון שיוצרת אנזים פעיל.

ביוכימיה – הרצאה (16.3.08)

2008-04-07T13:21:00.000-07:00

שיעור #15

הHill לא מבטא את חוזק הקישור. מקדם Hill הוא מדד לקואופרטיביות של התהליך – עד כמה קישור של מולקולת חמצן ישפיע על הקישור של המולקולה הבאה של חמצן.

מצב שנקרא DeOxy ומצב Oxy.

במצב Deoxy אין חמצן קשור להמוגלובין. במצב Oxy חמצן קשור להמוגלובין.

במצב Deoxy ההמוגלובין נוסע מהרקמות לריאות. במצב Oxy ההמוגלובין מסיע את החמצן מהריאות לרקמות. מצבים אלו הם הפיכים.

יש מצב המוגלובין שמתרחש כשנושמים גז CO – Carbon Monoxy. גז זה נקשר להמוגלובין יותר חזר מאשר חמצן. הרעלת CO היא מצב שבו ההמוגלובין נושא CO במקום חמצן, ומוביל למוות כתוצאה מחנק.

במצב של מעבר מoxy ל Deoxy, יש איזשהו ציר. בהשוואה בין שני מצבים אלו, אלפא-1 ובטא-1 מסתובב בזווית של 15 מעלות ביחס לאלפא-2 ובטא-2.

במצב Deoxy יש דבר חשוב נוסף: הC-טרמינל של התת יחידה בטא-2 לעומת C-טרמינל של בטא-1 נמצא בין חומצות האמינו 38 ו-41 של תת היחידה אלפא שנמצאת ליד. כאשר עוברים למצב Oxy הזנב מתרחק בצורה משמעותית מהחומצות 38 ו41.

אם מסתכלים על מצב הDeoxy טבעת ההם לא ישרה (לא מישורית) - הברזל שקשור להיסטידין הפרוקסימלי F8 נמצא מעליה. כאשר החמצן נקשר, מדברים על מצב של Transition (מצב מעבר). כשהחמצן נקשר הטבעת הופכת להיות ישרה (מישורית). כשהטבעת הופכת למישורית נוצרת הפרעה סטרית, והיא נוגעת בואלין FG5. הואלין זז כתוצאה מכך ימינה. מתזוזה זו אפשר למדוד שינוי של ההיסטידין ושל הברזל שקשור לחמצן. במצב הזה ההיסטידין מוטה 8 מעלות שמאלה. לבסוף, כתוצאה מקישור החמצן לברזל הם נמצאים על אותו ציר ורואים תזוזה של המבנה למצב הOxy.

אירוע נקודתי משפיע על כל מבנה ההמוגלובין. החמצן יכול לגרום לשינוי מבני בהמוגלובין כאשר הוא נקשר אליו.

בניסוי שעשו החליפו בהמוגלובין את ההיסטידין F8 בחומצת האמינו גליצין (מוטציה נקודתית מכוונת = SDN).

תיאורטית, אם אין קישור בין ההיסטדין לשרשרת ההליקס F, לא תהיה תזוזה.

כדי לבדוק זאת – הורידו את ההיסטדין והחליפו בגליצין. מבחינה כימית, צריך למצוא דרך לייצב את הברזל.

המולקולה Imidazole, שדומה בתכונותיה להיסטדין, נקשרת לברזל אך אינה נקשרת לשרשרת. מה שראו, זה שכאשר חמצן נקשר לברזל ולטבעת ההם, אין תזוזה של הF. מכך הסיקו שחייבים את ההיסטדין, ושאחד השינויים שהחמצן גרום להם הוא הזזת ההליקס F.

יש שני מודלים (ואחד נוסף בספר) לגבי קישור החמצן להמוגלובין ושינוי המבנה של תתי היחידות ממצב Deoxy למצב Oxy:

1. מודל KNF – Koshland, Nemethy & Filmer – לפיו אין חמצן באיזור וכולם במצב עגול. לאחר שחמצן מופיע ונקשר, הוא מייצב את מצב הoxy של ההמוגלובין ויוצר צורה של משולש במקום עיגול. מצב זה מעודד את התתי יחידות האלו שאינן קושרות חמצן, שליד אלו שקשרו חמצן, לעבור למצב מעבר לקראת מצב ה Oxy. זהו מצב Sequence.

2. מודל Concerted – MWC – Monod Wyman & Changeux – כולם מראש נכנסים לאותו מצב. במודל זה, בצורה הטבעית, בחלק קטן מהזמן, מולקולות ההמוגלובין הופכות למצב של Deoxy לחלקיק שניה. תמיד חלק מהמולקולה יהיה במצב Oxy כלשהו.

R – Oxy

T = Tense - Deoxy

יכול להיות שהתא במצב T אך עדיין קושר חמצן. החמצן ייקשר לT אך בצורה חלשה מאוד.

באינטראקציה בין המוגלובין לחמצן - כאשר הPH יורד, החמצן קשור חלש יותר להמוגלובין. בריאות יש אחוז גבוה של רוויה של קישור חמצן.

PH באזור 7.6, אחוז הרוויה הוא 70% ו30% השתחרר.

PH של 7.2, אחוז הרוויה הוא כ50% ו50% השתחרר.

ככל שהPH יודר, הזיקה של החמצן להמוגלובין יורדת.

ההיסטדין 146 שנמצא בקצה תת היחידה בטא, מסוגל ליצור גשר מלח עם החומצה האספרטית מס' 94 כל עוד הוא טעון חיובית. זה קורה במצב Deoxy.

במצב Oxy אין יצירת גשר מלח. הגשר מלח מייצב את הצורה הטעונה של ההיסטדין, ולכן הPKa של ההיסטדין עולה במצב Deoxy.

חשוב לזכור: פרוטונציה של היסטדין 146 מייצבת את המצב הdeoxy.

עליה בריכוז הפרוטונים גורמת לירידה בPH, ויש שחרור מוגבר יותר של חמצן.

יצירה של חומצה לקטית תוריד את הPH (כתוצאה ממאמץ יתר) גם גורמת לשחרור חמצן ברקמות.

Hb-4O2 + nH+ <---> Hb-nH- + 4O2

ההשפעה של הפרוטונים איננה רק על ההיסטדין (יש ח. אמינו נוספות שמושפעות מהשינוי בחומציות) אך אנו נתייחס רק להשפעה על ההיסטדין 146.

האפקט של שחרור חמצן מוגבר נקרא אפקט בור (Bohr Effect).

איך הCO2 מגיע לריאות ויוצא?

הCO2 לא נקשר באותו אתר של החמצן. הוא יכול לעבור בדיפוזיה בדם. ביקרבונט נמצא בדם ומגיע עד הריאות, ובריאות מתבצעת תגובה לכיוון ההפוך והCO2 משתחרר.

ש תגובה חשובה שנקראת קרבמאט: CO2 שהפך לביקרבונאט יכול להקשר ישירות להמוגלובין. בשרשרת הפוליפפטידית של ההמוגלובין שיירים של +NH3 שפוגשים ביקרבונאט, הH והO נופלים ונוצר קרבמאט: -NCOO. נוצר גם פרוטון וגם מים. הפרוטון מוריד את הPH ברקמות, מה שמגביר את אפקט בור.

צורה הקרבמאט מיוצבת במצב Deoxy, וכאשר מגיעים לריאות ויש מעבר ממצב Deoxy לoxy התגובות הולכות לכיוון קליטה של פרוטון ומים, עליה בPH ויצירה של ביקרבונטא שיחל את התהליך שוב. הCO2 בריאות ישתחרר, וכך הוא מסולק.

לאנשים מעשנים יש רמות גבוהות של BPG בגוף – Bisphosphoglicerate.

זו תרכובת שנקשרת למצב Deoxy של המוגלובין ומייצבת אותו. מצב זה מעודד שחרור חמצן. מתברר שבמקומות גבוהים הגוף מרגיש בזה, ומייצר BPG בדם.

בריאות עדיין נוכל לקלוט חמצן, אך ברקמות יש פחות חמצן, ולכן יש יעול של שחרור החמצן בעזרת ייעול המצב הdeoxy.

Fetal Respiration

ההמוגלובין של העובר שונה מזה של אדם בוגר – הוא מורכב מ2 שרשראות אלפא ו2 שרשראות גמא (במקום בטא). הגמא פחות מושפע מהBPG ולכן הוא יותר במצב Oxy והוא יוכל לקחת חמצן מאימו בקלות (אפיניות גבוהה).

במהלך ההיריון יש הרבה שרשראות אלפא, הרבה גמא ומעט בטא. לאחר כ9 חודשים אין יותר גמא בדם של אישה הרה.

ביוכימיה – הרצאה (11.3.08)

2008-03-17T04:50:00.000-07:00

שיעור #14

הערה: המבחן לשתי הקבוצות (ביוטכנולוגיה וביולוגיה) יהיה משותף!

נושא ההרצאה: המשך המבנה הראשונ, השניוני והשלישוני.

כיצד ניתן לחזות איך החלבון שמקודד לDNA נראה?
את המבנה השלישוני קשה לקבוע.
משתמשים באלגוריתמים כדי לקבוע את המבנים. למבנה שניוני יש סקלות שעוזרות לנבא מה הם הסיכויים שח. אמינו אחת תהיה מבנה א' ולא מבנה ב'. אם אף אחת משלושת האפשרויות (אלפא-הליקס, משטח-בטא, או TURN) לא מתקיימת...
אנו קובעים ציון כלשהו לכל מבנה (למשל גליצין וואלין) ומשתמשים בטבלה להצגת הציונים של כל מבנה באזור ספציפי של החלבון.
אם הציון של אלפא-הליקס גבוה יותר, למשל, אז אנו מניחים שזה יהיה המבנה עבור האזור הספציפי שאליו התיחסנו. זה נקרא ניבוי, או Prediction.

עבור BPTI, הצליחו לנבא את המבנה השניוני בעזרת אלגוריתמים. אם משווים את הניבוי למבנה האמיתי, רואים שהם דומים מאוד.
כדי לנבא את המבנה השלישוני, משתמשים במבנים דומים (ברצף) שכבר נפתרו.
יש הרבה קבוצות שבונות תוכנות מחשב שמנסות לפענח מבנים של חלבונים לפי מודלים שכבר נפתרו והאלגוריתם שלהם נשמר בסוד.

סיכום פרק 6
ידוע שיש כמה רמות מבנה. הרמה הראשונית היא רצף ח. האמינו.
רצף המבנה השניוני הוא אלפא-הליקס או משטחי-בטא. המבנה השלישוני הוא התארגנות השרשרת הפוליפפטידית במרחב.
המבנה הרבעוני הוא התארגנות של תתי יחידות (בפרק הבא).
מבחינת מבנה שניוני, יש מס' קטן של מבנים מותרים מבחינה סטרית, והם מיוצבים על ידי קשרי מימן.
לחלבונים גלובולריים יש פנים הידרופובי וחוץ הידרופילי.
התרמודינמיקה של הקיפול שלהם תלוי בדינמיקה והאנטרופיה של המערכתץ חלבונים קטנים נוטים להתקפל לבד וחלבונים גדולים צריכים עזרה מצ'אפרונים – חלבונים שעוזרים לחלבונים אחרים להתקפל בתא ומונעים דנטורציה ואגרגציה שלהם.
דנטורציה של חלבונים יכולה להגרם על ידי עליה בטמפרטורה או שינוי בPH.
הסיכוי לניבוי של מבנה שלישוני של חלבון גדול יותר אם מתבססים על מבנה ידוע של חלבון קיים, אך הוא עדיין לא ודאי (נכון להיום).

גלובינים
אורניזמים רבים בטבע זקוקים לחמצן במטבוליזם שלהם. יש אורגניזמים פשוטים שלא צריכים העברה אקטיבית של חמצן (חרקים, למשל). אורגניזמים גדולים ומורכבים יותר צריכים להעביר חמצן לכל חלקי גופם בהעברה אקטיבית.
תפקיד החלבונים ממשפחת הגלובינים (מיוגלובין והמוגלובין) הוא לקשור חמצן.
המיוגלובין (נמצא ברקמות) אוגר חמצן לעת צרה.
ההמוגלובין מעביר החמצן מהריאות לרקמות.

המבנה
המבנה של המיוגלובין ושל ההמוגלובין דומים. הם בנויים מ8 אלפא-הליקס (כל אחד). הסלילים שלהם נקראים A, B, C... H.
70% מהשרשרת הפוליפפטידית היא במבני אלפא-הליקס. אין מבנה הרבעוני של מיוגלובין. לעומת זאת, המבנה הרבעוני של ההמוגלובין הוא של 4 תת יחידות, ש2 מהן הן תת יחידות שלפא, ו2 הן תתי יחידות בטא.
התתי יחידות דומות בינהן, וגם דומות למבנה המיוגלובין.
ההמוגלובין גודלו כ150 ח. אמינו לכל תת-יחידה (כ600 ח. אמינו סה"כ) כאשר כל תת יחידה יכולה לקשור רק מולקולת חמצן אחת (O2).
קבוצת הHEME (קבוצה פרוסטטית) היא קבוצה כימית שאינה מהווה חלק מהחלבון אך נמצאת בחלבון. הקבוצה הזו בנויה
יש משפחה גדולה של תרכובות שנקראות פורפירינים. אחד החלבונים במשפחה זו נקרא פורפין. כאשר מבצעים שינויים בטבעת כלשהי, החלבון הופך לפרוטופורפרין-9. אם מורידים 2H ומוסיפים ברזל, מקבל פרופרוטופורפרין (או קבוצת ההם = HEME). המבנה הזה הוא בעל צבע, וכאשר הוא מתחבר לברזל צבעו אדום. עם מגנזיום צבעו יהיה ירוק (בכלורופיל). עם נחושת הוא יהיה כחול.
הברזל יכול ליצור 6 קשרים: 4 נוצרים עם הטבעת הפרוטופורפירינית, קשר נוסף נוצר עם ההיסטידין שנמצא בהליקס F8 או היסטידין 93. החמצן לא קשור בצורה קוולנטית בגלל הקונפיגורציה. הוא מיוצב על ידי טבעת הN והברזל.
היסטדין נוסף מייצב את החמצן בצד השני והוא נקרא E7 או היסטדין 64.
להיסטדין הקרוב יותר (היסטדין 93) לטבעת הN קוראים PROXIMAL.
להיסטדין הרחוק יותר קוראים DISTAL.

כאשר החמצן צריך להשתחרר הוא עובר ממקום למקום בתוך הסביבה של טבעת הn וההליקסים – זהו תהליך דינמי שבו החמצן עובר ממקום למקום (ב"קפיצות") עד שהוא יוצא.

תהליך הקשירה של החמצן למיוגלובין (MB)
Mb + O2 --> MbO2

מגדירים את הערך [טטא]: שיעור תפוסת המיוגלובין על ידי החמצן.
טטא הוא מספר האתרים התפוסים (SITES OCCUPIED) חלקי סה"כ האתרים האפשריים (TOTAL AVAILABLE SITES).

[להעתיק משוואות מהמצגת]

חוק הנרי: הריכוז של גז מסויים שמומס בתוך נוזל הוא פרופורציונאלי לריכוז אותו גז שנמצא מעל הנוזל.
לכן, אפשר להגדיר את טטא כלחץ החמצן חלקיי לחץ חלקי של חמצן שגורם ל50% מהמיוגלובין להיות תפוס + לחץ חלקי של המערכת.

תהליך הקשירה צריך להיות יעיל (בגלל שיש צורך לאגור את החמצן).
כפי שניתן לראות בגרף, כבר בריכוזים נמוכים של החמצן המיוגלובין תופס אותו חזק (תפוסה גבוהה).

[להעתיק גרף מהמצגת]

להמוגלובין יש 4 תתי-יחידות.
אם מסתכלים על גרף של קשירה חזקה שלו לחמצן, נוכל לשחרר רק חלק קטן ממנו (כ10% מכלל שיעור ההמוגלובין התפוס) וזה תהליך לא יעיל.
אם הקשירה תהיה חלשה, ההמוגלובין יוכל לשחרר חמצן בקלות ברקמות אבל בריאות הוא ישחרר רק כ50%-60% ולכן גם אז זה לא יהיה יעיל.
הפתרון הוא קשירה חזקה בריאות וקשירה חלשה ברקמות.
העקומה, שמתעקמת בצורה סיגמואידלית (שצורתה S), מגדירה מושג שנקרא קואופרטיביות – אינטראקציה קואופרטיבית.
בתתי היחידות כל אחת עוזרת לשכנתה להבין מהי הצריכה של קישור החמצן באותו הרגע.
הקואופרטיביות אומרת שתתי היחידות ירצו לקשור חמצן (אם אחת משחררת חמצן, האחרות גם ישאפו לשחרור חמצן).
התנהגות קואופרטיבית היא חלק מאפקט רחב יותר בביוכימיה שנקרא האפקט האלוסטרי (שאומר שקישור של ליגנד לחלבון משפיע על האפיניות של שאר תתי היחידות או אתרי הקישור במולקולה).

עקומת היל – Hill Plot
בקישור ההמוגלובין לחמצן, בציר הX יש LOG של הלחץ החלקי של החמצן.
בציר הY יש טטא חלקיי 1 חלקיי טטא.
הטטא בהמוגלובין נתונה על ידי לחץ חלקי של חמצן בחזקת n חלקיי לחץ ב50% בחזקת n + לחץ חלקי בחזקת n.
ניתן להפוך את המשוואה הזו למשוואה עם LOG.

[משוואות מהמצגת]

הn הוא השיפוע של גרף היל. בהמוגלובין הוא שווה ל1.
במקרה של המוגלובין הn משתנה לאורך לחצים שונים של חמצן. משמעות שינוי השיפוע היא הזיקה לחמצן.
קישור החמצן הראשון מתנהג כשיפוע של 1. השיפוע משתנה ויכול לעלות עד כ3.5 .
במצב הזה, קישור לחמצן השני והשלישי מתבצע בזיקה חזקה יותר מאשר הקישור של החמצן הראשון.
למולקולה של 3 חמצנים יש אתר קישור אחד שנותר, ובמצב כזה השיפוע גם יהיה 1.
למצב שבו השיפוע הכי חזק, כ3.5, קוראים מצב מעבר.
המצב ההתחלתי שבו השיפוע 1 נקרא מצב קישור חלש.
המצב האחרון שבו השיפוע גם 1 נקרא מצב קישור חזק.

ביוכימיה - הרצאה (9.3.08)

2008-03-17T04:04:00.000-07:00

שיעור #13

Glubular Proteins – חלבונים גלובולריים
אלו חלבונים שיוצרים מבנה תלת מימדי שדומה לכדור. הם אוסף של מבנים שניוניים (α-הליקס, ומשטחי- β). המידע על קיפול החלבונים מגיע מדפרקציה של קרני-X, וכך מקבלים את האינפורמציה על קיפולי החלבון. לפעמים הדיפרקציה מגיעה ל0.3 ננומטר – דבר שמאפשר לעקוב אחרי המבנה המרחבי החלבון ומאפשר לראות ממה הוא מורכב.
BPTI – מעכב של טריפסין (מסונתז בלבלב של פרות), הוא אנזים שעושה פרוטוליזה לחלבונים אחרים.
פרוטיאזות = אנזימים שחותכים חלבון אחר. לפעמים רוצים להפסיק פעילות כזו ואז קושרים חלבון BPTI שעוצר את הטריפסין (הופך אותו לבלתי פעיל).
BPTI מורכב מ154 חומצות אמינו. בתצוגת מודל-שלד (Skeletal) אפשר להציג את המבנה המרחבי של החלבון. ניתן למדוד את המרחקים בין אטומים של חלבון בעזרת דפרקציה של קרני X.
דרך נוספת להציג את החלבון היא להראות מבנים שניוניים של החלבון היא Ribbon Model – תצוגה שמראה את המבנה השניוני של החלבון. מבנים שניוניים שמחוברים בינם לבין עצמם ללא סידור מוגדר נחשבים כ Random Coil.
צורה שלישית היא Space Filling Model היא צורה שמראה עד כמה החלבון דחוס.
אוסף של כל האטומים של חלבון מסתדרים למבנה דמוי כדור, ומכאן השם "חלבונים גלובולריים".

מיוגלובין (Myoglobin) הוא חלבון שקושר חמצן. אם נסתכל על צורת השלד שלו, נוכל לראות את הברזל. למיוגלובין יש קבוצה פרוסטטית – מולקולה קטנה שנקשרת לחלבון בצורה לא קוולנטית ומקנה לו פונקציה כלשהי. הקבוצה הפרוסטטית נקראת "הם".
כ70% מהמיוגלובין מורכב מ α-הליקס שקשורים בינהם ללא צורה ספציפית. זה נכון לגבי כל חלבון גלובולרי – המבנה התלת מימדי של כל חלבון ייחודי לו.

כל החלבונים מורכבים מאותם מבנים שניוניים שחוזרים על עצמם. אפשר לראות מכנה משותף: לחלבונים כבדים יש Domain שמכיל אזור מקופל. החלבון הגדול הוא אוסף של מבנים שמקופלים ומחוברים בינהם במבנים אקראיים. חלבון BPTI מכיל Domain אחד בלבד כי הוא יחסית קטן.
יש חלבונים שמכילי Domain שקושר ATP או סובסטרט כלשהו. ה Domain בנויים על 2 עקרונות:
1. על בסיס α-הליקס – קיפולים על גבי קיפולים.
2. על בסיס משטחי- β

עד היום נאסף הרבה מאוד מידע לגבי חלבונים שונים ורבים. מצאו ש:
לכל החלבונים הגלובולריים יש אזורים פנים וחוץ מוגדרים. מחוץ לחלבון יש חומצות אמינו הידרופיליות, ובפנים הידרופוביות. אנו יוצרים סביבה הידרופובית בתוך החלבון.
האזור החיצוני מייצב את החלבון על ידי קשרי מימן.
המבנים של β-sheets בד"כ גורמים לצורה מרחבית של חבית - Barrel (צורה יציבה יותר לחלבון).

שרשרת פוליפפטידית יכולה לשנות כיוון. אם עוקבים אחריה, אפשר לראות שהיא יכולה להתקפל על עצמה ולפנות לכיוון אחר (אפילו 180 מעלות או יותר). סיבוב כזה נקרא Turn, וקיימים מספר סיבובים:
1) סיבוב בטא – β-TURN. בסיבוב זה יש 4 חומצות אמינו שיוצרות את הסיבוב. הסיבוב נוצר על ידי קשרי מימן של חמצן קרבונילי של ח. אמינית מס' 1 לבין אמיד של ח. אמינו מספר 4.
2) סיבובים דחוסים יותר, GAMA-TURN, קשר מימן נוצר בין חמצן קרבונילי על חומצה אמינית מספרן 1 לבין אמיד של ח. אמינית מס' 3.
לא כל מבנה של חלבון ניתן לשייך לקבוצה – קיימים מבנים אקראיים ולא מוגדרים.
כל הגורמים הנ"ל מגדירים חלבון גלובולרי.
הרצף של חומצות האמינו בחלבון קובעת את המבנה המרחבי של החלבון.
להלן מספר נתונים\הוכחות שמראים כי רצף חומצות האמינו אכן קובע את המבנה התלת-מימדי של החלבון:

הוכחה ראשונה:
שינוי ח. אמינו אחת בחלבון יכולה לשנות לחלוטין את המבנה המרחבי של החלבון.
באריטרוציט קיים חלבון ההמוגלובין. כאשר בהמוגלובין יש מוטציה כלשהי היא הופכת אותו לצורה חרמשית הדומה לאות C במקום צורה של O. הפנוטיפ של מוטציה זו גורם למחלת האנמיה.
האינפורמציה לגבי המבנה השלישוני של החלבון קשורה לרצף ח. האמינו שלו.

הוכחה שניה:
של Anfinsen. בשנות ה50 עשה את הניסויים שהביאו אותו לתגליות הבאות:
הוא עבד על חלבון ריבונוקליאז-A שמפרק מולקולות RNA. הוא לקח את החלבון הזה בצורתו המקופלת\נאטיבית (התלת מימדית). בחלבון הזה יש קשרי S-S דיסולפידים, שנובעים מקישור של ציסטאינים. הוא ראה שיש לו חלבון מקופל עם קשרי S-S ועשה לו דנטורציה (דנטורציה נגרמת ע"י שינוי בPH או חימום. גם אוריאה [שתנן] גורם לדנטורציה). אם בחלבון יש קשרי S-S (קשרים קוולנטים חזקים) ורוצים לפרק אותם, חייבים לחזר את החלבון על ידי בטא-מרקפטו-אתאנול.
הוא לקח RNA והוסיף לו חומר זה, וקיבל שרשרת פוליפפטידית פתוחה ולא מקופלת. אחרי זה הוא העביר את החלבון לתמיסה שלא מכילה את החומרים שגורמים לדנטורציה, וראה שהחלבון שוב מתקפל לאותו מבנה שלישוני שהיה מצוי בו בהתחלה.
ככל שמעלים טמפרטורה, החלבון עובר יותר Unfolding ; המבנה השלישוני של החלבון מוכתב ע"י המבנה הראשוני שלו.

התרמודינמיקה של הקיפול
אם רוצים ששרשרת פוליפפטידית תהפוך למקופלת, השינוי באנרגיה החופשית צריך להיות שלילי (ΔG).
השינוי באנטלפיה (ΔH) הוא החום שנקלט או נפלט מהמערכת. אם הוא שלילי, גם ΔG שלילי. בקיפול חלבונים, יוצרים הרבה קשרים מועדפים אנרגטית שיוצרים את המבנה המרחבי של החלבון. קשר מטען-מטען (או גשר מלח) הוא בין שייר ח. אמינו שלילי לבין שייר טעון חיובית (למשל בין ליזין לגלוטומאט). קשר זה גורם למשיכה אלקטרוסטטית ותלוי בPH בו החלבון מצוי. בPH נייטרלי שתי הקבוצות טעונות. בPH חומצי מאוד או בסיסי מאוד, אחד השיירים לא יהיה טעון, ונאבד את האינטראקציה ונקבל דנטורציה של החלבון. קשרים אלו מייצבים את המבנה השלישוני של החלבון.

גם קשרי מימן גם מייצבים את המבנה השלישוני של החלבון.
קשרי ונדרולס גם מייצבים את החלבון, למרות שהם חלשים.
מה שגורם לייצוב מבנה החלבון בסופו של דבר הוא כמות הקשרים. הרבה קשרים מייצבים את החלבון בצורה טובה יותר.
כל שלושת הקשרים הללו אינם קוולנטים. קשרים קוולנטים הם חזקים מאוד, ולכן קשה מאוד לשבור אותם.

אנתרופיה – רמת האי-סדר של המערכת.
כדי ש ΔG יהיה שלילי יותר, כך האנטרופיה צריכה להיות יותר חיובית.
אם האנטרופיה ירדה, ה ΔG יהיה חיובי יותר. זה אנטרופיה של קונפורמציה שפועלת נגד ה"רצון" של החלבון להתקפל.

כאשר שרשרת פוליפפטידית פתוחה, הקשרים ההידרופוביים פונים למים, והמים יוצרים סביבם מבנים מסודרים של גביש. כאשר החלבון מתקפל כל הח. אמינו ההידרופוביות שלו נכנסות לחלבון. האנטרופיה של המערכת גדלה. ΔS חיובי, וגורם ל ΔG להיות שלילי.
אנטרופיה של קונפורמציה פועלת נגד רצון החלבון להתקפל. הגורם השני – האפקט ההידרופובי – פועל לטובת קיפול החלבון. אם נסתכל על כל הכוחות הפועלים ביחד, ΔG יהיה שלילי ונקבל העדפה אנרגטית.

יש חשיבות רבה לח. אמינו הידרופוביות בחלבון. לפי טבלה אפשר לקבוע את ההידרופוביות היחסית של כל ח. אמינו. כל סקלה יכולה להגיד איזו ח. אמינו היא הידרופובית ואיזו הידרופילית. חובה לעבוד עם סקלה אחת כל הזמן.

מה נוצר קודם – קיפול החלבון או קשרי הS-S?
אם נרצה ליצור בין 8 ציסטאינים - קשרי S-S, נוכל לקבל 105 אפשרויות: אם יש 8 ציסטאיניים, לראשון יש 7 אפשרויות קשירה לכל אחד מהאחרים. לבא אחריו יש 5 אפשרויות. סה"כ יש 3x5x7 = 105 אפשרויות!
קודם החלבון מתקפל לצורה תלת מימדית ורק אח"כ נוצרים קשרי S-S שמחזקים את המולקולה. לBPTI יש 3 קשרי S-S.
בסביבה מחוזרת אין קשרי S-S, ורק לחלבונים שמופרשים מתוך התא יש קשרי S-S שמייצבים את המבנה שלו.

סיכום ביניים:
סביבה ציטוזולית לא מאפשרת יצירת קשרי S-S. חלבונים מחוץ לתא, עובדים בסביבה מחמצנת, והציסטאינים שלהם כן יכולים ליצור קשרי S-S שמייצבים את המבנה המרחבי של החלבון.

בתוך התא, לא כל החלבונים מסוגלים להתקפל לבד וזקוקים לעזרה.
משפחה של חלבונים, צ'אפרונים, תפקידה לעזור לחלבונים להתקפל. (צ'אפרון = מלווה).
יש הרבה משפחות של צ'אפרונים:
1) מקורה בחיידק: GroEL, GroES. שני חלבונים אלו שייכים לאותה משפחה. GroEL מורכב מ2 טבעות. כל טבעת מורכבת מ7 תת-יחידות ובתוך כל טבעת יש חלל. החלבון הלא מקופל נכנס לחלל הזה, וכדי להשאר שם, חלבון GroES מכסה אותו, ומקבלים מבנה שדומה למבחנה עם מכסה (שהחלבון לכוד בפנים). הGroES מבודד את החלבון מהסביבה ונותן לו סביבה הידרופובית, והחלבון הלא מקופל ממתין. כאשר החלבון מתקפל, המכסה עוזב ומשחרר את החלבון. על ידי יצירת סביבה הידרופובית יוצרים מצב קל לחלבון להתקפל.
2) משפחה של DnaK – חלבון מחיידק ששייך למשפחה של חלבוני HSP – Heat Shock Proteins. תפקידו של DnaK הוא להקשר לשרשרת פוליפפטידית לא מקופלת ולאפשר לה להתקפל לבד. אחרי התרגום יש שרשרת פוליפפטידית שעדיין לא הספיקה להתקפל. היא יכולה לפגוש שרשרת אחרת, ונקבל קשרים הידרופוביים בין שתי שרשראות ונקבל חלבון שלא יכול להתקפל. מצב כזה נקרא אגרגציה. חלבון שיוצר אגרגאט הוא חלבון לא פעיל. DNAK מונע מהשרשרת הפוליפפטידית להקשר לשרשראות אחרות. אחרי מכת חום, כאשר שרשרת פוליפפטידית לא מקופלת נקשרת לDnaJ, הוא מגייס את הDnaK. DnaK יכול להקשר לשרשרת פוליפפטידית לא מקופלת. לDnaK יש 2 Domains – אחד אחראי לקישור ATP והשני אחראי לקישור של סובסטראט.
כאשר DnaK קשור לATP האפיניות שלו לקשירת שרשרת פוליפפטידית נמוכה מאוד. כאשר ADP קשור לDnaK, הוא נקשר לשרשרת חזק.
כשרוצים לשחרר את השרשרת, הופכים ADP בחזרה לATP על ידי חלבון שלישי שנקרא GrpE שמחליף את הADP בATP. עכשיו לDnaK יש אפיניות נמוכה, והוא משתחרר מהשרשרת הפוליפפטידית.

פריאונים – PRIONS
מחלת הפרה המשוגעת נגרמת ע"י פריאונים.
ב1996, סטנלי פרוזינר, גילה שהפרה המשוגעת עוברת על ידי חלבונים. הפריאון, הוא חלבון שנקרא PRPC – Prion Related Protein Cellular.
מסיבה לא ידועה, החלבון יכול לשנות את צורתו ל PRP Scrapie (מחלה שדומה לפרה המשוגעת אך קיימת בכבשים) שהוא חלבון מסוכן שיוצר סיבים בתא ומחורר את מערכת העצבים של בעל חיים.
PRPC נמצא בגוף, אך לא ידועים בדיוק את תפקידו. מה שכן יודעים, זה שPRP SCRAPPIE הוא הצורה הרעה של החלבון, והוא מדבק וגורם למוות של חיות (או בני אדם).

ביוכימיה - הרצאה (4.3.08)

2008-03-06T04:40:00.000-08:00

שיעור #12
אימייל של המרצה: cohency@mail.biu.ac.il

החלק הראשון מוסבר בפרקים 6,7 של הספר והחלק השני מוסבר בפרק 11 בספר.

רמה ראשונה של חלבון – היא המבנה הראשוני של החלבון. יש גם מבנה שניוני, שלישוני ורבעוני של חלבון.
חלבונים מורכבים ממבנים רבים שלעתים חוזרים על עצמם.
במבנה הראשוני הוא רצף חומצות האמינו, והוא מכיל את רוב המידע והאינפורמציה לקיפול החלבון. ישנם מודיפיקציות לאחר סינתזת השרשרת הפפטידית שיכולות להשפיע על המבנה, אך רוב המידע נמצא על המבנה הראשוני.
יש מבנים מאופיינים שחוזרים על עצמם בחלבונים.
מבנה אחד הוא אלפא-הליקס, ומבנה שני הוא משטחי-בטא.
קשרי מימן חשובים כי הם מייצבים את המבנה.

המדען פאולין, החל לעבוד בשנות ה30 על פענוח מבנים. הוא האמין שהמידע שהוא יוכל להשיג מפפטידים יוכל לעזור לו להבין איך חלבון מתקבל ומהו המבנה שלו.
לקח לו כ20 שנה עד שהצליח להגדיר כללים ועקרונות (עקרונות פאולינג, שמתחלקים ל4) שקשורים להתהוות.

המבנה של חלבונים:
1. חלבון גדול בעל מס' גדול של שיירים (100+) - הזוויות והמרחקים בקשרים הפפטידיים במולקולה גדולה כזו צריכים להיות דומים לאלו שבמולקולות קטנות. כלומר, אין שוני גדול במרחקים ובזוויות בין פפטיד קצר ובין חלבון גדול.
2. שני אטומים לא יוכלו להתקרב אחד לשני יותר מאשר הרדיוס של כוחות ונדר-ולס מתירים להם.
3. קבוצת האמיד חייבת להשאר במישור.
4. רוטציה או סיבוב בין ח. האמינו מתאפשרת רק בקשר לפחמן אלפא. (כדאי להסתכל על התמונות בפרק 6 בספר)
5. חייבים קשרים לא קוולנטים כדי ליצב את מבנה החלבון. קשר המימן הוא הנפוץ ביותר במקרה הזה.

הכללים האלו מגבילים מבחינה כימית את המבנה השניוני. אנו יכולים לחלק מבנה שניוני ל2 קבוצות עיקריות: אלפא-הליקס, או משטחי-בטא.
ישנם מבנים אחרים שמקיימים את הכללים בכל זאת. אחד הוא אלפא-3-10, שהוא מבנה דחוס מבחינת הסליל ביחס לאלפא-הליקס. יש גם מבנה אחר, פאי-הליקס שלא נצפה בטבע למרות שמבחינה כימית הוא אפשרי.

אחד הערכים לתיאור מבנה שניוני הוא n. n הוא מספר חומצות האמינו בסיבוב אחד.
במקרה של אלפא-הליקס יש 18 חומצות אמינו ב5 סיבובים.
כלומר, n לא חייב להיות מספר שלם. במקרה הזה הוא 3.6.

יש 2 ערכים נוספים:
H – הפרש הגובה בין שתי חומצות אמינו עוקבות על אותו סליל.
ה PITCH – מסמל את הגובה של סיבוב אחד שלם.

P = n x H

H של אלפא הליקס הוא 0.15 ננומטר, והP הוא 0.54 ננומטר. כלומר האורך של סיבוב אחד הוא 0.54 ננומטר.

לפי מספר האטומים שמפרידים בין חמצן (מס' 1 למימן שאיתו הוא יוצר את קשר המימן) אנו מאפיינים מבנים שניוניים.
הקשר השני הוא 3-10 : 3 = כל סיבוב של הסליל מכיל 3 ח. אמינו. 10 = המימן העשירי בשרשרת שאיתו החמצן יוצר את הקשר.
באותה שרשרת, אותו מימן הוא מספר 13, ולכן דרך נוספת לתאר את האלפא-הליקס היא: מס' ח. אמינו, 13=המספר של אטום המימן.

השרשראות קשורות בצורה לא קוולנטית בינהן ע"י קשרי מימן של אותו חמצן שיכול לפגוש את המימן שממולו, והפוך.
אנו מגדירים 2 סוגים של מבנה של משטחי-בטא:
מקביל (Parallel) ואנטי-פרלל (Anti-Parallel).
במבנה מקביל, השרשראות שיוצרות את המשטח הן בעלות כיווניות זהה.
במשטח האנטי-פרלל, השרשראות שיוצרות את המבנה "רצות" בכיוונים הפוכים.

שני פרמטרים נוספים שניגע בהם בעתיד:
*) הסיבובים של המבנים
*) מבנה Random-Coil – שרשרת פוליפפטידית שאין לה מבנה מוגדר.

ניתן לאפיין קשר פפטידי ע"י זווית:זווית המישור השמאלי= פאיי,וזווית המישור הימני = פסאיי (בדוגמא במצגת).
אי אפשר ששני הקשרים האלו יקבלו ערכים בין 0 ל 180 מעלות, מכיוון שמבחינה כימית יש מבנים אסורים (הפרעה סטרית). שני המישורים מחוברים בעזרת פחמן האלפא.

הכימאי Ramachandran ניסה לצייר מפות של קשר של הזוויות האפשריות בין 2 ח. אמינו. הוא צייר מפה מ0 עד +180 או -180, שבה בדק מהן הזוויות המותרות כדי שהמבנה הזה יהיה אפשרי עבור החלבונים. הוא הגחע למסקנה שאותם מבנים אפשריים בתחום מסויים של זוויות. יש מבנה אפשרי שמכיל את הסליל – הוא הסליל בסיבוב שמאלי.
כשמעתיקים את הנתונים על מפה, מגלים שרוב האטומים נופלים באזורים מותרים.
החומצות האמינו שיוצאות מהכלל הן בעיקר גליצין (שהיא גמישה ואין לה שייר).
ניתן להסיק, שאם פסאיי ופאיי הן באותן זוויות (אך נגדיות) הן נמצאות באותו אזור.
המפה הזו נותנת מושג לגבי המבנה השניוני של פחמן אלפא.

חלבונים
חלבונים מתחלקים ל2 חלקים:
1. חלבונים סיביים (Fibers Proteins)
2. חלבונים גלובולריים
לקבוצה 1 יש מבנה של סיבים (או חוטים). אלו חלבונים חשובים מאוד במבנה התא, הגרעין והציטופלסמה. נמצא אותם בעיקר בעור, בציפורניים, בשיער, ברקמות חיבור וגם במשי.
לעומתם, לחלבונים גלובלריים יש מבנה קומפקטי. הם חשובים מבחינה מטאבולית, אנזימטית ומעבר של מולקולות בתוך התא.

החלבונים הסיביים
חלבונים אלו קשורים ביצירת מבנים או כאשר אנו צריכים חוזק מכני. הם חשובים ברקמות חיבור או יצירת קורי עכביש, למשל. חלבון המשי הוא משטח.
מבנים של קרטין וקולגן לא נמצאים בחלבונים אחרים.

יש 4 משפחות עיקריות:
קרטיניים – אלפא-קרטין קשור לשיער והציפורניים. בטא-קרטין מופיעים בנוצות וקסקסים.
פיברואין – נמצאת במשי ובקורי עכביש.
קולגן – נמצא בעיקר בעצמות ובעור.
אלסטין – נמצא בגידים ובכלי הדם.

כל מונומר מכיל כ300 ח. אמינו, וכל ח. אמינו רביעית או שביעית היא הידרופובית. (בגלל שיש 3.6 חומצות אמינו בסיבוב). הקרטין יוצר צד אחד שהוא יותר בידרופובי לאורך כל הסליל, שמתחבר לצד ההידרופובי של הסליל השני.

קשרים דיסולפידים נמצאים יותר בציפורניים ובשיער מסולסל, לעומת שיער חלק.
בשיער, מבנה האלפא-קרטין הוא שמשפיע על סילסול השיער.

משפחת הפיברואינים:
הם יוצרים את מבנה קורי העכביש. אךו מבנים של משטחי בטא עם הרבה גליצינים -
(Glycin). הם יוצרים מבנה חזק מאוד, וגם גמיש. ישנם אזורים במשטח שמכילים הרבה ואלין או טירוזין, ששוברים את המבנה המישורי של בטא ומפשרים גמישות.
הפברואין נוצר כתוצאה של משטחי בטא אחד על השני.

משפחת הקולגן
המבנה הבסיסי של קולגן (בעצמות, גידים, עור) הוא מבנה של 3 הליקס עם סיבוב שמאלי.
בד"כ גליצין היא חומצה שלישית (נמצאת במרכז הסליל) ומקנה גמישות לסליל, והn שלו 3.3. הפרולין, לעומת זאת, מקשה על הגמישות.
הידרוקסיפרולין קשורים למחלה. הפיכה של פרולין אליו נעשית ע"י אנזים שתלוי בויטמין C. כאשר יש חוסר בויטמין C, אין מספיק הידרוקסיפרולין, ומאחר וקולגן מכיל ריכוז גבוה של הידרוקסיפרולין, חוסר בו, מחליש את המבנה של הקולגן וגורם לדימומים בחניכיים. מחלה זו נקראת Scurby.

משפחת האלסטין
בצינורות כלי דם חשובה הגמישות. אותם חלבונים מאוד גמישים וחזקים. רוב ח. האמינו הן גליצין אלנין, ואלין ולפעמים גם ליזין. האלסטין שונה מהמשפחות הקודמות, בכך שהמבנה שלו פחות מסודר – אין לו מבנה שניוני מוגדר (כמו אלפא הליקס ובטא שיטס). הליזינים הם אלו שיוצרים קשרים בין החלקים של החלבון – קשרים מיוחדים שנקראים דסמוזין, שנוצרים ע"י חיבור של 4 ליזינים שמחוברים ע"י השיירים. הוא שנותן תכונות גמישות לאלסטין.

ביוכימיה - הרצאה (2.3.08)

2008-03-06T04:22:00.000-08:00

ביוכימיה – שיעור #11

תהליך התרגום TRANSLATION ומנגנוני תיקון DNA.
מבחינה ביוכימית בP-Site הפפטיד מחובר לtRNA מהסבב הקודם. מתרחשת התקפה ונוצר קשר פפטידי ע"י האנזים. אתר A פנוי מקבל ח. אמינית חדשה.
בריבוזום יש 3 אתרים: A, P וE.
ה tRNA הזקן עובר מP לA, ומA לE, ע"י קפיצה כל 3 נוקליאוטידים.

בפרוקריוטים, יש חלבוני Release Factors שמתחברים לאתר הסיום.
יש RF1 ויש RF2 שמזהים את הרצפים. הם נכנסים לאתר A של הסטופ-קודון.
כל פפטיד שיצרנו שלם, והוא יעשה את פעולתו בתא. לאחר שחרור הפוליפפטיד נכנס פקטור RF3 שמחוברת אליו מולקולת GTP. הRF3 מסלק את RF2 או RF1, ובשלב השני מגיע פקטור RRF – Ribosome Recycle Factor עם EF3+GRP.
כל המבנה משתחרר – tRNA וmRNA וRF יוצאים החוצה.
קיבלנו שתי יחידות של הריבוזום. מבנה הריבוזומים הרבים על הmRNA נקרא פוליריבוזום. אפשר להגיע עד לכ-50 ריבוזומים לmRNA אחד.

באאוקריוטים:
הRNA הריבוזומלי מיוצר בגרעינון שם הוא מורכב ע"י הRNA-פול-1 מ18S, 28S ו5S.
תת היחידה הגדולה היא60S והקטנה 40S, וביחד מקבלים 80S.
בתת יחידה הגדולה יש את ה28S וה5.8S וגם מולקולת 5S שהיא Ribosomal RNA. בפרוקריוטים אין את ה5.8S.
הDNA הריבוזומלי מיצר את rRNA. הציפוי של הrRNA מתורגם בציטופלסמה ונכנס בImport לתוך הגרעין – משם לגרעינון, ומשם מורכבים לתת היחידות של הריבוזום. משם הן עוברות Export כתת יחידות 60S ו40S ומבצעות תרגום בציטופלסמה.
הריבוזומים בציטופלסמה קיימים ב2 מקומות מרכזיים:
או בציטופלסמה בצורה חופשית או בER – Endoplasmic Reticulum,
תלוי בסוג החלבון שהריבוזומים מתרגמים.
חלבונים שצריכים אותם כמסיסים בציטופלסמה מתורגמים בציטופלסמה. חלבונים שיש להעביר דרך הממברנה מתורגמים על גבי הממברנה של הER.
באאוקריוטים אין רצף Shine Dalgarno, שמביא את הריבוזום למקום שבו הtRNA מתחיל לתרגם.
תת היחידה הקטנה מגיעה עם עוד חלבונים, ובtRNA יש בקצה ה5' את הCAP שמגן עליו מדגרדציה, והוא מכוון את הריבוזום לmRNA.
חלבון שנקרא EIF – Eucariotic Initiation Factor מגיע לקצה ה5' של הmRNA וקורא עד שמגיע לרצף הAUG – קודון התחלה.
בנוסף, חלבוני EIF מסוגים שונים גם עושים פעילויות שונות.
הריבוזום מביא את תת היחידה הגדולה כשהוא מגיע לAUG. אותם האתרים קיימים גם באאוקריוטים – P, E, וA.
באאוקריוטים המבנה של הmRNA הוא מעגלי והריבוזומים נעים עליו. הריבוזום הראשון מתיישב עליו ולכל אורך הmRNA יושבים ריבוזומים שונים שיכולים לתרגם בו-זמנית. רק באאוקריוטים הmRNA יכול להיות מעגלי.

הריבוזומים יודעים להקשר לממברנה של הER ולבצע את התרגום של חלבונים מסויימים רק שם (על הממברנה שלו).
דרך אחת היא לסנתז חלבון שיכנס דרך הממברנה ללומן של הER:
בקצה הN-טרמינלי של הפפטיד שנוצר, יש קוד לSignal Sequence – שורה של ח. אמינו שתופסות חלבון SRP, שמתיישב על הרצף הזה של הSignal Peptide, מפסיק את התרגום ומביא את המולקולה לER.
SRP מתחבר לרצפטור על הממברנה של הER. כשהריבוזום והSRP והרצפטור מגיעים לתעלה, SRP הולך והפפטיד שנוצר משתחל פנימה לתעלה. החלבון זורם פנימה ומתורגם ע"י הריבוזום. כשהתרגום מסתיים מתרחשת טרמינציה והחלבון יוצא החוצה.
בדרך השניה, החלבון מגיע באותו האופן לER, אך הוא נשאר מעוגן בחלק החיצוני של הממברנה והופך לחלבון ממברנלי – רצפטור. תעלה שמכניסה גלוקוז לתוך התא היא חלבון מסוג כזה, למשל.

REPLICATION
תהליכים של Proof Reading – כאשר הפולימראז בודק את עצמו, אך עדיין יכולות להיות טעויות. אפשר לגרום לשינוי בבסיסים – וע"י כך למוטציה.
התא יודע להתאבד אם צריך, אך קודם לכן הוא ינסה לסדר את עצמו.

Direct Repair – תיקון ישיר של הנזק שנגרםץ
BER – Base Exision Repair – הוצאת בסיס, והכנסת בסיס אחר במקומו.
Nucleotide Exision Repair – NER – יש החלפה של מקטע שלם שבו יש פגם. האזור הפגוע נשלף החוצה גם אם לא כל הנוקליאוטידים נפגעים.
רקומבינציה – שני הכרומוזומים באים במגע ומשוחלפים, במיוזה למשל. זה קורה גם כתהליך תיקון של DNA.
Mismatch Repair – כאשר הפולימראז מכניס נוקליאוטיד שגוי למשל A מול G, הוא משנה אותו בחזרה לנוקליאוטיד הנכון.

נזק של אור UV לDNA – גורם למוטציות או בעיות בתא. קרן UV מכניסה אנרגיה למבנה הDNA ויכולה ליצור קשרים קוולנטים לא רצויים בין בסיסים.
אפשר לקבל למשל שני בסיסים T המחוברים זה לזה – מוטציה שהתא לא "רגיל" אליה, אך לתא יש דרכים רבות להתמודד עם תופעה זו.
דימרים של T ניתנים לתיקון באופן ישיר (אך לא אצל בני אדם).
כאשר יש לנו בסיסים שעוברים התמרה – חומרים מסויימים יכולים להלביש קבוצה מתילית על G למשל, ומקבלים O-Methyl-Guanine. קשר מימן אחד שירד, גורם ל2 קשרי מימן במקום 3 בין C לG, והתא חושב לשים מול G את הנוקליאוטיד T בזמן ההכפלה, ואחרי שתי הכפלות מתקבלים בסיסים T-A.
מוטציה של רצף G מול C, הופכת בסופו של דבר לA מול T.
אנזים שנקרא אלקיל-טרנספראז עושה טרנספר למתיל, ומחזיר את המתיל-גואנין לגואנין. כך החומר הגנטי לא משתנה ושומר על עצמו.

בBER, הגדילים נפתחים בתהלך ההכפלה, אך משום מה במקום T נכנס נוקליאוטיד U. אנזים שנקרא גליקוזילאז שקוצץ את הבסיס U החוצה – השרשרת של הפוספט והסוכר נשארת שלמה. ואז האנזים אנדונוקליאז מנתק את הקשר בין את הקשר שפוספודיאסטרי בין שני הנוקליאוטידים. DNA-פול-1 עושה NIP-Translation (פולימריזיציה חדשה לDNA). בסוף מגיע ליגאז שסוגר את הNIP ומקבלים בסופו של דבר DNA תקין.

כאשר חומר כלשהו מוריד לC את האמין שלו (דאמינציה) מקבלים Uracil (רק בDNA). התא לא יכול לסבול את זה. כדי לתקן את זה, מתבצע תהליך תיקון BER.
מנגנון נוסף של BER מורכב מתהליכים של חמצון (כדאי לקרוא בספר).
התמרות של חמצן גורמות לבעיות. לתא יש שורה של אנזימים שמטפלים בחמצונים ואוקסידציות.

NER:
התא מחליט לסלק אזור שלם. C שעבר דימריזציה עם T, למשל, מתוקן ע"י מערכת חלבונים שחותכת חתיכה שלמה שמכילה את הטעות (כולל נוקליאוטידים תקינים) וDNA-פול מגיע ומשלים את הנוקליאוטידים שהוצאו.
התא מזהה דימר שגוי על ידי עיוות במבנה הDNA ע"י חלבונים.

בחיידקים, יש חלבוני UVR שסורקים את הDNA עד שמגיעים לתקלה. כשהם מזהים אותה, הם מפילים את הA-ים, וחלבון חדש UVR-C מגיע והB מסמן את גבולות הגזרה שמהם יש לחתוך – נעשים NIP בשני הצדדים וחלבון חדש UVR-D שהוא הליקאז, פותח את הDNA. באחד הגדילים שנוצרו מהפתיחה יש NIPS, וDNA-פולימראז שמגיע יודע לתקן אותו.
בדימרים של טימין ברור אילו דימרים הם הבעייתיים. הגדיל השני מבחינת התא הוא בסדר.
Mismatch Repair – טעות של הDNA-פולימראז: התא צריך להחליט מי מהבסיסים הוא השגוי. זה מתרחש בתהליכי הכפלה או באזורים בעייתיים שבהם הפולימראז משבש את הסדר בגלל חזרות של רצפים, למשל.
הידיעה לגבי נכונות הגדיל מתבצעת לפי מנגנון מתילציה ע"ג הDNA. גדיל האם מגיע עם מתילציה וגדיל האם הוא ללא מתילציה... בזמן שניתן להבדיל מיהו גדיל האם ומיהו גדיל הבת ניתן לזהות את הטעות (בפרוקריוטים).
ע"י חלבוני זיהוי שנקראים MUT זה קורה:
MUT S עושה Looping Out על הDNA, והMISMATCH יושב על הלולאה.
חלבונים מזהים מיהו גדיל האם ומיהו גדיל הבת. אחרי שהם מזהים את הבעיה יש חיתוך, ומגיע הליקאז שפותח את המבנה. יש סילוק של האזור הבעייתי, וDNA-פולימראז מגיע עם ליגאז וסוגר את האזור.
חשבו לציין, שהתהליך הזה קורה מיד אחרי ההכפלה, כי רק אז יש "חלון הזדמנויות" שבו ניתן להבדיל בין הגדילים לפי המתילציה.

שני קצוות של כרומוזום מתנתקים, ויש קצוות חופשיים. מצב זה בעייתי וגורם לחוסר יציבות של הגנום. התא יכול להתאבד אחרי דבר כזה.
אם אין הרבה מקרים כאלו, התא ינסה לתקן זאת ע"י חלבונים שנתפסים על הקצוות השבורים ומחברים אותם בחזרה.
בתהליך ההדבקה ייתכן מצב שבו יש איבוד מידע (כי הם אוכלים חלק מהתא) אך לרוב המידע הזה אינו בעל חשיבות גדולה. תיקונים אלו בד"כ מתרחשים בתאים בוגרים שלא עוברים לדורות הבאים.

רקומבינציה
שחלופים בין הכרומוזומים נותנים תכונות חדשות במיוזה.
תהליכים של רקומבינציה – נוגדים TCELLS, שבהם אזורים בגנום קופצים ממקום אחד לשני כדי ליצור סוגים שונים של חלבונים.
הגוף יודע לפתח נוגדים לECOLI שחודר אליו, למשל, ע"י חיבור חתיכות שונות של חלבונים (רקומבינציה).
טרנספוזומים גם יודעים לעשות רקומבינציה – אלו חתיכות DNA שקופצות ממקום למקום בDNA.
בעיות חריפות בDNA, גורמות לתא להתאבד, או שהתא ינסה לעבור רקומבינציה וכך לתקן את עצמו.

צריך לדעת למבחן:
כל החומר עד סוף תהליך התרגום.DNA REPAIR – רק מה שנאמר בשיעורים.

ביוכימיה - הרצאה (26.2.08)

2008-03-01T08:42:00.000-08:00

שיעור #10

תרגום

הריבוזום מתיישב על שרשרת הmRNA ויוצר שרשרת של ח. אמינו - פוליפפטידים. שלושה נוקליאוטידים נקודדים לח. אמינו אחת המתאימה.
בחיידקים הקודים לפעמים שונים מעט מאלו של בני אדם, אך באופן כללי הקוד נשמר במהלך האבולוציה.
הtRNA היא מולקולת RNA שבקצה התחתון שלה יש לולאה ואנטי-קודון שנקשר לmRNA.
הtRNA מביא את החומצה האמינית המתאימה לmRNA.
כדי להתחיל שרשרת פפטיד, יש קוד AUG שמקודד להתחלת התהליך באאוקריוטים. בפרוקריוטים N-Formylmethionine יושב על הtRNA. הפורמיל יורד ורק הח. אמינו מתיונין נשארת. קיים מנגנון שיכול להחליף את המתיונין.

בחיידקים:
ב Lac-Operon יש שלושה גנים. לאחר יצירת mRNA שמכיל את שלושת הגנים, צריך ליצור מהם חלבונים. בLac-Z יש קודון התחלה, וגם בLac-G ובLac-A.
בLac-Z ובLac-G יש רצף AUG. לפני הרצף הזה, קיים רצף עשיר בבסיסי A וG, שנקרא גם Shine Dalgarno Sequence.
שלושה ריבוזומים מתרגמים את הmRNA לפני כל רצף AUG עד אזור הStop Codon.
הStop Codon מפיל את הtRNA ולא מאפשר לו להמשיך - גם הריבוזום נופל.
מאותו הmRNA נוצרים חלבונים שונים.
רצף הShine Dalgarno נמצא כ10 בסיסים upstream ביחס לגן.

תת היחידה בקטנה של הריבוזום, היא הכ16s-Robosomal-RNA. לחלק זה יש רצף ספציפי שקושר את הריבוזום לmRNA ע"י זיהוי של רצף הShine Dalgarno.
בגנים שונים, ה16s יכול להיות שונה כדי להכיר רצפים שונים בmRNA.

tRNA

צורתו של הtRNA היא תלתן. זו מולקולה חד-גדילית שמתקפלת על עצמה ויוצרת מבנה של Stem-loop. אחת הלולאות האלו היא האנטיקודון שמזהה את הקודון על הmRNA.
על מולקולות הtRNA מסתיימות ברצף "CCA" בקצה ה3'.
מבנהו התלת מימדי שמור אך האנטי קודון שונה בהתאם לרצף על הגן. יש כמה נקודות קבועות בtRNA. מולקולה זו עוברת הרבה מודיפיקציות (ביגור) שמשנות את הנוקליאוטידים.
אחת מהן היא פסוידו-יורידין, למשל.
אזור הstem loop, האנטי קודון, הוא האזור היחידי שמכיר את הmRNA.

האנזים אמינו-אציל-tRNA-סינתאז מבצע את תהליך חיבור ח. האמינו לtRNA.
הוא לוקח ח. אמינית ומאקטב אותה ע"י ATP. הATP מתחבר לח. האמינית ונותן אמינו-אציל-אדנילאט. בקשר הפוספט של ATP משתמשים לחיבור ח. אמינית.
הפירופוספט (שתי מוקולות פוספט שמשתחררות) מתפרק לשני פוספטים בודדים ומשחרר הרבה אנרגיה.
הח. האמינית הטעונה יכולה להתחבר לtRNA. בA האחרון של הCCA יש קבוצת הידרוקסיל. הח. אמינית מתחברת לOH ע"י קשר קוולנטי.
המולקולה החדשה היא אמינו-אציל-tRNA. שתיים או שלוש פריים.

האנזים שמלביש את חומצת האמינו סרין על הtRNA יודע לזהות 4 סוגי tRNA (שכל אחד מהן מקודד לסרין).
לא קיים אנזים tRNA-סינתאז עבור N-פורמיל-מתיונין שמצמיד אותו לtRNA אלא חלק מהtRNA עובר התמרה ע"י הוספת פורמיל. חלק מהכרת המולקולה נעשית בזכות ההתמרות.
קיימת גם יכולת בדיקה עצמית של האנזים (Proof Reading) ותיקון במקרה הצורך.
UAC בmRNA מכיר את הGUA בtRNA.
מוטציה יכולה להוביל לשיבושים בתא. לחיידק יש יכולת לדלג מעל קודון בעזרת שימוש במוטציה: במקום GUA הוא יוצר CUA באנטי קודון של הtRNA. אמנם בmRNA יש UAG, אבל הtRNA המתאיםלו גם יביא טירוזין ונקבל מולקולה תקינה.
בדרך זו, על ידי שתי מוטציות בלבד בtRNA, שמביא את הטירוזין לmRNA מקבלים חלבון עם ח. אמינו נכונה בסופו של דבר. תהליך זה נקרא Supressor-Mutation.

אנטי קודון

שני הנוקליאוטידים הראשונים בtRNA חייביים להתאים לנוקליאוטידים בmRNA. במקום השלישי (שנקרא גם "wobble") יכול להופיע U במקום G, למשל, מכיוון שבהרבה מקרים הוא לא משפיע כל עוד שני הנוקליאוטידים הראשונים מתאימים. הסיבה היא, שהרבה חומצות אמינו בעלות שני נוקליאוטידים ראשונים זהים מקודדות לאותה ח. אמינו כאשר לא משנה מה הוא הנוקליאוטיד השלישי .

בפרוקריוטים, תת היחידה הגדולה, 50S, של הריבוזום מורכבת מ23s ו-5s, ו 31 חלבונים בנוסף לכך. החלבונים נקראים L1 עד L31.
תת היחידה הקטנה מורכבת מ 16s, שגם היא מורכבת מתוספת של חלבונים, 21 חלבונים: S1 עד S21.
לתת היחידה הקטנה קוראים 30S.
צפיפות שתי היחידות ביחד היא 70S (היחידות אינן לינאריות, ולכן לא מהוות חיבור של שתי תתי היחידות).

המבנה של הrRNA, הוא חד גדיל של RNA שמקופל בStem Loop. המבנה השלישוני שלו מאפשר לו כניסה לריבוזום ולאתר את רצף הShine Dalgarno הספציפי. צורת הקיפול (המבנה השלישוני) שמורה באבולוציה, למעט יצורים מסויימים שקיפול ה16S שלהם שונה.
23s-RNA הוא גדול יותר ויוצר מבנה מיוחד. ה5s קטן ממנו.
תת היחידה 50s מביאה את הtRNA פנימה, וממנה יוצאת השרשרת הפוליפפטידית.
בחיידקים הmRNA מיוצר ממכיוון 5' ל3', והריבוזום יכול להתיישב על ה5' כך שהתרגום יכול להתבצע במקביל לשעתוק. סינתזת החלבון היא מהקצה הN-טרמינלי לקצה ה C-טרמינלי.
בתוך הריבוזום, הtRNA מתמקם באתר A (נקרא A-Site, או אמינו-אציל-tRNA). לידו יש P-Site
P = Peptidil, ואתר יציאה E-Site, שממנו הtRNA מתנתק ויוצא החוצה.

Initiation
30s ו50s צריכים לתרגם mRNA. ע"י פקטור IF3, שנקשר ל30s, הקשר בינהם מופרד (חייבת להתבצע הפרדה כדי שתהליך התרגום יוכל להתחיל להתבצע).
בשלב הבא (שמתבצע במקביל), צריך להגיע הtRNA-פורמיל-מתיונין (הראשון) לmRNA:
פקטור הבנוי מ IF1 ו- IF2 נקשר לGTP ונושא עימו גם N-פורמיל-מתיונין-tRNA.
הGTP (מולקולה מקבוצת G-Proteins) משחררת אנרגיה ומאפשרת את התהליך.
הקשר בין tRNA לmRNA הוא ללא תלות בתת יחידה הגדולה. נוצר קומפלס לmRNA, tRNA, פקטורי IF1, IF3, ו-50s.
ה IF1 וIF3 מונעים מtRNA אחר לבוא ולהתחבר. כל הקומפלקס הזה נקרא Initiation Complex ומאפשר את התחלת התרגום.
בהמשך, נפרדים IF3 וIF1 ותת היחידה הגדולה 50s מתווספת. GTP משתחרר והופך לGDP שמשנה את מבנה תת היחידה הקטנה, ועכשיו היא יכולה להתחבר לתת היחידה הגדולה, ומתקבל קופלקס חדש - 70s.
הIF2 משתחרר במקביל להגעת ה50s.

תהליך הElongation

בקצה הN-טרמינלי יש N-פורמיל-מיונין. פקטור EF-TU (שמחוברת לו מולקולת GTP, וtRNA מתאים) מביא את הmRNA.
באתר הA-Site הריק, tRNA מתאים מתיישב בפנים בזכות הפקטור EF-TU. בתהליך משתחררת מולקולת GTP והופכת לGDP, ועוזרת לtRNA למצוא את מקומו.
הGTP שהופך לGDP משחרר הרבה אנרגיה, וע"י פקטור נוסף, EF-TS, שגם אליו מחוברת מולקולת GTP, הוא מסלק את הGDP שעל הEF-TU, ומתקבל קומפלקס חדש של EF-TU שמחובר לEF-TS.
ה EF-TS יורד, וה EF-TU נשאר עם מולקולת GTP.
את הח. אמינו שיש לחבר לשרשרת שנוצרה יש להוסיף לקצה הC-טרמינלי של הפפטיד.
הפפטיד "קופץ" מאתר P לאתר A, ומתחבר לחומצת האמינו ע"י פעילות אנזימטית מתוך התת יחידה של הריבוזום (פפטיטין-טראנספראז). קיבלנו פפטיד ארוך יותר בח. אמינו אחת (1+).
בתת היחידה הגדולה שבריבוזום,האנזים שמבצע את הפעילות הכימית הוא RNA (או Rybozime).

ביוכימיה - הרצאה (24.2.08)

2008-02-26T11:40:00.000-08:00

שיעור #9

לא ידוע אם יש הליקאז לפני RNA-פולימראז-3. לפני RNA-פולימראז-2 קיים הליקאז.
מלבד הפקטורים הבסיסיים (Basal Factors) בכל פתיחה של גן עבוד RNA-פולימראז-2, יש כאלו ספציפיים לרצף מסויים באזור הפרומוטור. בנוסף ל TATA Box, לגן כלשהו יהיה פקטור מסויים. הפקטור הזה מגביר את התדירות שהפרומוטור שולח לפולימראז, כך שהוא יוציא mRNA בתדירות גבוהה יותר.

פקטורי השעתוק האלו קשורים לאקטיבטורים ולרפרסורים (כולם קשורים זה לזה בצורה כלשהי) ולPre Initiation Complex.
פקטור שעתוק מכיל אזור שקושר DNA - זהו אזור חלבוני שנקשר לMajor Groove ונצמד אליו ע"י כך שהו מזהה רצף פנימי בתוכו. הוא נקשר כדימר (זוג חלבונים) לDNA. אזור זה בפקטור השעתוק נקרא DNA Binding Domain.
החלק השני, הActivation Domain, אינו קושר DNA, אבל קושר חלבונים אחרים - פקטורי שעתוק אחרים או אקטיבטורים. הקשרים האלו יוצרים את הפעילות האקטיבית של הפרומוטור.
שני פקטורים יכולים להשפיע ביחד ברמה של מכפלת היעילות של שניהם (אם אחד מגדיל את היעילות פי 5, והשני מגדיל את היעילות פי 10, אז שניהם ביחד מגדילים את היעילות פי 50).

הגן ציקלין-D1 קשור למחזור התא; הבקרה על הביטוי שלו מאוד ייחודית. פקטורים מסויימים יכולים לגרום לייצור עודף שלו, ואחרים יכולים לגרום למוטציות שמבטלות אותו או גורמות לבעיות.

אופן הקשירה לDNA
קיים מבנה ספציפי יודע לקשור את החלבון.
בחלבון יש אזור שנקרא Zinc Finger שיודע לקשור את הDNA.
חלבון מסוג כזה הוא TF3A. ע"י הכנסת יון אבץ לתוך סליל של חומצת אמינו, נוצרת מעין לולאה בצורת אצבע (שמורכבת מHis ו Cys). האצבע נכנסת לMajor Groove בDNA ונקשרת אליו. זהו למעשה הDNA Binding Domain.
לחלבון אחד יכולות להיות כמה אצבעות שנקשרות לDNA במקומות שונים. השיירים שנמצאים על האצבע הם אלו שמבצעים את פעולת הקשירה.

Helix-Turn-Helix - זהו מבנה בחלבון שיכול להקשר לDNA. שני סלילי-אלפא (α helices) המופרדים ע"י רצף קצר של חומצות אמינו.
Helix-Loop-Helix - מבנה שמופיע בד"כ כדימר - שני "מקלות" שנקשרים לDNA משני הצדדים.
Leucine-Zipper - (לאוצין היא חומצת אמינו) - שני "מקלות" הצמודים זה לזה ע"י "ריצ'ראצ'" של לוצינין אחד ליד השני. כל חומצת אמינו שביעית ברצף, בערך, היא לוצין.

Elongation

RNA-פולימראז-2 לפעמים מנסה לשעתק ולא מצליח, ומתחיל שוב את התהליך מההתחלה.
ח. האמינו סרין יכולה לעבור פוספורילציה (יש רק עוד 2 ח. אמינו נוספות שיכולות לעבור פוספורילציה מלבד סרין).
RNA-פולימראז-2 צריך לעבור בקרה כדי לעבור מתהליך הInitiation לElongation, והוא Hypo-phosphoralization. הסרין אצלו, שממוקם בזנב, צריך לעבור זרחון. הפולימראז לא יכול להתחיל להאריך את השרשרת לפני שפקטור נוסף מזרחן את סרין 2. אחרי שסרין 5 וגם 2 מזורחנות, יצירת הmRNA יכולה להתחיל.
הRNA איננו מזורחן כאשר הוא מגיע לפרומוטור.
RNA-פולימראז-2 הראשון שמגיע נקרא Pioneer (חלוץ). אחריו יגיעו פולימראזות אחרים כאשר להם יש כבר Pre-Initiation-Complex מוכן. בסוף הגן, הRNA-פול-2 צריך סימן שיגרום לו לעצור.
mRNA שנוצר עובר עיבוד בקצה 3'של הסיגנל AAUAAA. אחריו יש מרווח של 10-30 נוקליאוטידים ואז רצף של 2 נוק': CA, אח"כ 30 נוקליאוטידים נוספים ואז רצף עשיר ב G או GU.
אנזים שחותך חלק מסויים בשרשרת, מותיר את הmRNA שמתחיל ברצף AAUAAA חשוף. כדי להגל עליו, נוספים לו 250 נוקליאוטידים מסוג A. רצף זה נקרא Poly-A-Tail או זנב פולי-A. על הזנב הזה יושבים החלבונים CstF ו CPSF. כשמגיע הרצף "AAUAAA" זהו סימן שהפולימראז הגיע לקצה הגן, ושני החלבונים האלו מתנתקים מהפולימראז ומתחברים לשרשרת הRNA בקצה ה3' שהופקה ממנו במקום.

כ 15-25 נוקליאוטידים אחרי ה AAUAAA יש חיתוך של ה RNA, והפולימראז נופל מהגן. החיתוך נעשה ע"י CPSF וCSTF.
ה Poly-A-Tail מוסיף את הרצף של 250 נוקליאוטידים מסוג "A" ואח"כ משתחרר. הוא קשור למספר גדול של חלבונים אותם הוא מצפה. חלבון הPABP - Poly-A Binding Protein הוא שנקשר לזנב הPoly-A ומצפה אותו בקצה 3': כך הוא לא יכול להאכל ע"י נוקליאזות. כל mRNA חייב להיות מוגן על-ידיו בקצה 3' שלו.
גם קצה 5' צריך להיות מוגן, וזה נעשה ע"י קבוצה של חלבונים המבצעים mRNA-Capping. הכיפה הזו, הCap, היא נוקליאוטיד ששמו 7-מתיל-גואנזין (m7G), והוא מחובר לmRNA ע"י גשר של 3 פוספטים, שבקצה ה5' שלו הm7G יושב, וכך השרשרת לא יכולה להתארך יותר. הוא מגן על הRNA מפני האקסונוקליאזות שיכולות לבצע Decapping.
הCap גם עוזר לכוון את הריבוזום אל הmRNA.
כל התהליכים האלו מתרחשים במקביל (Splicing, Capping, PolyA וכו').

Splicing

ביצורים אאוקריוטים קיים תהליך הSplicing הייחודי, שבו נחתכים רצפי אאינטרונים, והאקסונים מודבקים זה לזה (האקסונים מהווים את הרצפים המקודדים בגנום) ויוצרים mRNA בוגר. האינטרונים הם רצף אינו מקודד.
יש חלבונים שמזהים את החיבור בין האינטרונים לאקסונים. החיתוך בינהם נוצר במבנה של לולאה. חלבונים נוספים חותכים בקצה 3', וחלבונים אחרים מדביקים את האקסונים מחדש אחד לשני לפי הסדר.

אזור קונצנזוס - האקסונים הם בד"כ חלקים קטנים יותר מהאינטרונים, וניתן לנבא בערך איך יראה הmRNA לאחר הספלייסינג. חלבונים שנקראים ספלייסוזומים, המורכבים בעיקר מsnRNPs - מולקולות של חלבונים וRNA קטן, הם בעיקר אלו שמבצעים את התהליך. הספלייסוזום מורכב בעיקר מu1, u2, u3, u4, u5, u6:
u1 מתלבש בתחילת הרצף. u2 מתלבש על הBranch Point.
חלבוני הu יכולים לזהות אזורים מסויימים לפי רצף הRNA שלהם, שמתחבר לקצה ה5' של האינטרון. u1 יכול לעזוב, וu6 מתחבר במקומו - זהו מבנה דינמי.

Alternative Splicing

מנגנון הAlternative Splicing מאפשר לקבל מאותו גן צורות שונות של RNA. בתא מוח למשל, יתקבל מבנה כלשהו של RNA, ובתא כיליה יתקבל מבנה שונה.
בשני שרירים שונים גם יכולים להתקבל מבנים שונים של mRNA כתוצאה מספלייסינג שונה קצת שמותאם לסוג התא.

mRNA Editing

מצאו שיש תהליכי עריכה במקומות מסויימים- מודיפיקציה מסויימת על נוקליאוטיד בmRNA.

דאמינציה של C (ע"י האנזים דאמינאז) שהופך ל-U. אם יש קודום שמקודד לח. אמינית, הוא יכול לשנות אותו ועל כן יש לכך חשיבות גדולה.
סוג אחר של עריכה, הוא דאמינציה של A, וקבלת נוקליאוטיד חדש במקומו -I=Inozine שנמצא בRNA.
האנזים שקורא את I חושב שהוא G ולכן זה דומה להפיכת A ל-G.
ADAV - שם האנזים שמחליף את A ב-I; הוא מתיישב על הmRNA ומזהה את הA המתאים ומבצע דאמינציה עליו.
חלבון Apolipoprotein-B (בקצרה ApoB) חשוב עבור חומצות שומן. באקסון 26 יש קודון שבmRNA שלו הוא מקודד לח. אמינו גלוטמין בכבד. במעי, לעומת זאת, יש תהליכי editing שבהם דאמינציה של C ונקבל UAA במקום CAA. הרצף UAA הוא סימן לעצירה (Stop-Codon) וכך נקבל במעי הגס חלבון בעל רצף קצר יותר.

תהליך הExport: אחרי שmRNA עובר ביגור ויש לתרגם אותו, הוא יוצא דרך שוער הגרעין ומגיע לציטופלסמה - שם הוא עובר תרגום לחלבון ומתפרק.
הmRNA מצופים בחלבונים הקשורים לספלייסינג וחלקם נושרים בדרך. יש חלבונים שמלווים אותו רק עד הציטופלסמה או רק בחלק מסויים בו נמצא הmRNA.
תהליך השעתוק הוא תהליך של יצור הmRNA, שתפקידו לקשר בין הDNA ליצירת חלבונים.

תרגום - Translation

התרגום מתרחש אך ורק בציטופלסמה. ה-mRNA כבר נוצר. הריבוזום קורא מקצה 5' לכיוון 3' : קודון-קודון.
לכל קודון הוא מביא tRNA, שיש לו 3 אתרים. tRNA יושב בריזובוזום ומביא איתו ח. אמינית. הריבוזום מורכב מ2 חלקים (גדול וקטו).

הקוד הגנטי

Degenerate Code - מצב שבו יש יותר מקודון אחד עבור אותה חומצת אמינו.
קיים רק רצף אחד שמקודד להתחלה: AUG, ולעומת זאת 3 רצפים שמקודדים לסיום (Stop Codons).

ביוכימיה - הרצאה (19.2.08)

2008-02-24T13:13:00.000-08:00

שיעור #8

מבנה הDNA הוא מעין צורה שדומה לחרוזים על שרשרת. ה"חרוזים" הם הנוקליאוזום.
חוקרים גילו כי קיים קשר בין כמויות ההיסטונים השונים - יש כמויות כפולות של ההיסטונים H2,H3,H4 יותר מאשר H1.
אורך כל שרשרת כזו הוא כ100 אנגסטרם.
כאשר לקחו DNA ארוז בנוקליאוזום והוסיפו לו נוקליאז (DNAse שחותך DNA דו-גדילי) מצאו שהוא מסוגל לחתוך רק באזורים שבין הנוקליאוזום, וכך קיבלו DNA שהחלקים שאינם חתוכים בו הם ה"חרוזים" - הנוקליאוזומים. כל גודל של ליפוף (גודל של נוקליאוזום) כזה הוא 200bp.
ע"י הוסיפת DNAse לDNA בהדרגה, וראו שלחתיכות הDNA שנוצרו היה קל יותר לנוע בתוך הג'ל, וגודל הקפיצות הוא כ200bp. הסיקו מכך שמבנה הנוקליאוזום הוא של היסטונים וזהו אורכו.
היקף הDNA מסביב ל"חרוז" הוא 145bp והלינקר-DNA הוא באורך של 55bp.

בניסוי נוסף, הוציאו את ההיסטון H1 מכרומטין. כתוצאה מכך השתבש מבנה הנוקליאוזום, והמסקנה הייתה שH1 חיוני למבנה הקומפקטי והתקין של הנוקליאוזום.
DNA ארוז בכרומוזום ומכווץ פי 10,000 יותר מאשר בצורתו הרפויה.
ביצורים פרוקריוטים אין היסטונים מכיוון שאין להם גרעין.
בתאים אאוקריוטים קיימים 3 סוגי RNA-פולימראז (RNA-פולימראז 1, 2 ו- 3).

RNA-פולימראז-1 נמצא בגרעינון ומסנתז rRNA (רנ"א ריבוזומלי). הוא עובד בעיקר על מולקולות rRNA ויש לו פרומוטור אחד. הריבוזום מתרגם את הRNA לחלבון.
18s היא היחידה הקטנה שמרכיבה את הrRNA
28s היא היחידה הגדולה שמרכיבה את הrRNA. מורכב מ2 תת-יחידות נוספות: 5.8s, 5s

באאורקיוטים יש חזרות של גנים, ובהם יש אזורים שמקודדים לrRNA השונים, בינהם יש אזורים פחות חשובים בDNA.
RNA-פולימראז-1 משעתק ממנו Pre-Ribosomal-RNA - Pre-rRNA - 45s.
אנזימי RNAse מבשילים את ה Pre-rRNA ומשאירים ממנו 18s, 28s ו5.8s בוגרים שמרכיבים ביחד ריבוזום.

הrRNA יכול לעבור מודיפיקציות (מתילציות, למשל)
מולקולות Small-RNAs שקשורות לגרעינון משועתקות ע"י פול-,2 מביאות חלבונים לrRNA ומבצעות עליו מתילציה.
ע"י כך הן תורמות לתהליך ההבשלה שלו.
*תזכורת: כדי להגיע למצב ההתחלה (initiation) יש צורך בפקטורי שעתוק - TF
RNA-פולימראז-3 - מתיישב על הפרומוטור שלפני הגן שהוא רוצה לשעתק. לשם כך הוא נעזר בTF (פקטור שעתוק, Transcription Factor) - הפקטורים הם TF3A, TF3B.
RNA-פולימראז-3 גם משעתק את rRNA 5s אשר חלק מצבר מולקולות הrRNA בגרעינון.

שעתוק של 5s rRNA
דרוש גם TF3A בזמן שעתוק של 5s כדי שיוכל לזהות את הפרומוטור. TF3A מתיישב על הגן ונמביא אליו את TF3C, ואז TF3B יכול להגיע לגן. רק אז, האנזים יכול להתחיל בשעתוק.

דרך ל"כיבוי" הגן:
כאשר נוצרות הרבה מולקולות של 5s ויש עודף שלהן, הן מתלפפות עם הTF3A והוא מתלפף ונחסם, ואינו מסוגל להתיישב על הפרומוטור - מה שגורם להפסקה של פעילות הגן.

RNA-פולימראז-2 - אצל אאוקריוטים הפרומוטור גדול בהרבה מאשר אצל פרוקריוטים ומורכב יותר, מכיוון שנקשרים אליו יותר פקטורים.
אזור שנקרא GC BOX קיים הרבה אצל גנים מסוג Housekeeping, שמבוטאים בכל הרקמות בגוף ברצף הבקרה שלהם.
אצל גנים ספציפים לרקמה מסויימת (כמו גן שמייצר גלוקוז שנמצא בכבד) מצאו רצפי TATA Box.

כדי שתהליך הinitiation יצא לפועל, הRNA-פולימראז-2 צריך ליצר קודם קומפלקס שמורכב מ GTF - General Translation Factors או BTF - Basal Translation Factors.
הTATA Box ממוקם Upstream (לפני הגן). TF2D הוא הקומפלקס הראשון שמתיישב על הTATA Box ויש בו מספר חלבונים: TBP - TTA Binding Protein, חלבון שנקשר לTATA Box.
גם TATA Binding Associated Factors שהם קבוצה אחרת של חלבונים (אין צורך בפירוט..)
TF2A מתחבר למולקולה ומחזק את הקשר. TF2B מסמן לRNA-פולימראז-2 את המקום בו הוא צריך להתיישב (לפני הגן).
TF2F מגיע ביחד עם RNA-פולימראז-2 ועוזר לו להתחבר (מושך אותו לפרומוטור).
TF2H-הליקאז פותח את הDNA כדי לאפשר לאנזים להתיישב ב"נוח".
לאחר שכל הפקטורים האלו סיימו את תפקידם, האנזים יכול להתחיל לעבוד.
CTD - C Terminus Domain - הקצה הC של האנזים ארוך כמו זנב וזהו אחד החלקים החשובים אצלו. בגלל שהרבה פקטורים יכולים להקשר אל הזנב הזה, רואים שאי אפשר להתחיל בתהליך השעתוק לפני שהCTD עובר זרחון.

TBP - (מסומן כסליל ירוק במצגת) על הTATA Domain ומקפל את הDNA. כתוצאה מהקיפול, אפשר להביא חלבונים אחרים להתיישב על הDNA. הTBP משמש תמיד כ Pre Initiation Complex גם כאשר אין TATA Box ברצף. גנים עם פחות רצפי TATA מבוטאים בצורה נמוכה.
ידוע היום שכ 2/3 מהגנים לא מכילים רצפי TATA Box. יש אתר אחר שנקרא Initiator, ובכל זאת TBP משתתף.

תאי הגוף שלנו נוצרים מתאי אב (Stem Cells). תא אב מתמיין לתא אב יותר מבוגר.
בתא צעיר (Embrionic Cell) שמו לב שאין ביטוי של β-גלובין (גן שמפיק תאי דם), ולעומתו תא דם אדום כן מבטא β-גלובין. בניסוי שנערך ביטאו קטע DNA בכל אחד מהתאים האלו וגילו שהDNA מתא הדם האדום נחתך בקלות רבה יותר מאשר התא הצעיר.
המסקנה הייתה שיש הבדל באריזת הDNA אצל תא צעיר, שעדיין אין שימוש בגנים שלו לעומת תא דם אדום שאצלו קיימת נגישות גבוהה לDNA-פולימראז-2.
DNA בעל רגישות גבוהה יותר מכונה: "DNA Hyper Sensitive Site".
אצל תא כבד, אזור הβ-גלובין דחוס מכיוון שהוא לא עושה שימוש בגן הזה, לעומת תא אדום שאצלו האזור הזה פתוח.

Chromatine Remodelling - הDNA נפתח ונסגר באזורים מסויימים. זהו נושא חדש שנמצא במחקר. יש אוסף שלם של חלבונים "רעבים" לאנרגיה שמושקעת בפתיחה וסגירה של DNA וחלק גדול מהאנרגיה בתא, הATP משמש לכך.
התהליכים האלו נעזרים בהיסטונים. קצוות ההיסטונים בולטים החוצה, ועליהם מתרחשות מודיפיקציות (למשל: אצטילציה, מתילציה, פוספורילציה, יוביקויטינציה ועוד...) בהתאם לחומצה האמינית, והן גורמות לשינויים במטענים שמכווצים או פותחים את הDNA בהתאמה.
אצטילציה על היסטין 3 יכולה להוביל לפתיחת כרומטין. מתילציה לעומת זאת מביאה לסגירה.

DNA Enchancers & Silencers - במרחק של כ100bp מהפרומוטור, יכולים להשפיע על השעתוק.
אם הDNA מתקפל ומגיע לפרומוטור, פעולת Enhancement נשעית ע"י רצף כזה מחלבון שנקרא Activator שמגביר את פעילות הפולימראז וגורם לו לעבוד מהר יותר.
אם יש צורך להשתיק אזור מסויים, התא משתמש באזור של Silencer שנמצא רחוק יחסית מהגן. גן של רפרסור משפיע על קצב פעילות הפולימראז ומכבה אותו.
Co-Activator - קומפלקס של אקטיבטור.

ביוכימיה - הרצאה (17.2.08)

2008-02-23T09:03:00.000-08:00

שיעור #7

שעתוק בחיידקים
Lac-Operon (!תזכורת: חיידקים אוהבים גלוקוז) - החיידק מנצל סוכרים להפקת אנרגיה.
β-גלוקוזידאז - כאשר הוספנו גלוקוז והוצאנו לקטוז, האנזים הזה הופיע אצל החיידקים.
אופרון - צבר של גנים שמבוטאים ביחד.

פרימאז יוצר חלבון, מעין תעלה, שמאפשרת כניסה של סוכר ספציפי לתאים (לקטוז).
גן A, אצטילאז - אנזים שמסלק רעלים מהתא שנכנסים דרך התעלה.
כשRNA-פולימראז מתיישב על הגן הוא מייצר mRNA אחד, שממנו מוצרים 3 חלבונים שונים.
פוליציסטרוניק-mRNA - מספר גנים שמבוטאים על אותו RNA.

מוטציה בגן Z (הוא הגן שמקודד לβ-גלוקוזידאז) גורמת לביטוי שני הגנים האחרים אך לא לביטוי הגן Z. הגנים האחרים, Y ו-A מבוטאים כרגיל.
מוטציות באזורי הבקרה נותנות שני פנוטיפים שונים:

ביטוי של הגנים כל הזמן, באופן מתמיד, קונסטיטוטיבי. (גם כאשר לא מתרחש תהליך שעתוק)
למרות שהתא מקבל לקטוז במצב של חוסר גלוקוז, הגנים לא מתבטאים. זה נקרא Non-Inducible.

מנגנון רגולציה ע"י עיכוב גן I יוצר mRNA-repressor (או Lac-I) שיוצר חלבון, וRNA-פולימראז לא מסוגל לשעתק. Lac-I מקודד לחלבון שמעכב את ביטוי האופרון - כשהוא מתיישב על אזור ה Lac-Operator הוא חוסם אנזימים אחרים. כאשר יש גלוקוז, הוא מעכב אנזימים המיועדים למטבוליזם של לקטוז.
כאשר יש גלוקוז, Lac-Repressor חוסם מעבר של RNA-פולימראז.
כאשר אין גלוקוז ויש לקטוז, הLac-Rep מאפשר לRNA-פולימראז לשעתק.

1-6-אלולקטוז הוא הInducer, נחתך ע"י β-גלוקוזידאז.
IPTF - חומר בעל מבנה דומה לזה של 1-6-אלולקטוז. הוא משפעל את המערכת אך, β-גלוקוזידאז לא חותך אותו.

Lac-Repressor - חלבון שיודע להכנס לאתרים ספציפיים על הDNA וחוסם מעבר של RNA-פולימראז אליהם. יש כ10 מולקולות כאלו בתא. המולקולה נקשרת לDNA חזק מאוד ואופן הקשירה של הרפרסור הוא מדוייק.
RNA-פולימראז למעשה יכול להתיישב על הDNA לפני ה Lac-Rep ולהמתין עד שהוא יתנתק, אך הוא לא יכול להמשיך בעבודה עד שהרפרסור יעזוב את הDNA.

המדענים Jacob & Monod גילו שני סוגי מוטאנטים: Constitutive ו- Non-Inducible. הם גילו:

בזמנם חשבו שהמולקולה המתווכת בין המצאות לקטוז לבין חוסר לקטוז היא Lac-Rep.
יש בקרה ברמה חיובית על הגן, האופרון (בנוסף לבקרה שלילית)

בקרה חיובית

אם החיידק מקבל גם גלוקוז וגם לקטוז, יש בקרה חיובית. רק כאשר אין גלוקוז ויש לקטוז, המערכת עובדהת כמתואר למעלה. החיידק משתמש רק בגלוקוז.
במצב של רמה גבוהה של גלוקוז בתוך התא, מולקולת ציקליק-AMP או (cAMP) מפעילה תהליכים בתא. אם מצב הגלוקוז גבוה, פעילות הcAMP נמוכה.
כאשר יש הרבה cAMP בתאף החיידק יכול לקשור מולקולת CRP, והCRP יכול להקשר לDNA באזור הפרומוטור, וכך עוזר לRNA-פולימראז לשעתק.
כאשר הגלוקוז בתא יורד, רוצים להשתמש בלקטוז, וזה נעשה ע"י ייצור של cAMP בזכות שחרור הבקרה השלילית, וכך מתאפשרת קשירה לCRP.

Antisense RNA - מצאו שבהרבה גנים RNA-פולימראז יכול לשעתק משני הצדדים. כשיש עודף mRNA למשל, וצריך ליצור גדיל נגדי יש עיכוב ביצירת mRNA.
בריבוזום יש חלבון שעוטף RNA.
מצאו שה rRNA וה- tRNA מהווים 1% מתוך השעתוק בתא. mRNA היא מולקולה בלתי יציבה שמתפרקת מהר, ורוב המולקולות RNA המסנתזות בתא הן מסוג mRNA. למרות זאת, בזמן נתון בתא יש הרבה יותר מולקולות של tRNA ו- rRNA. הן מיוצרות ע"י אופרנים שמייצרים במקום mRNA את tRNA ו- rRNA.
אנזימים קוצצים את ה Pre-RNA שנוצר לחתיכות (RNAse, רנ"אזות)
ונוצר מערך של Post-Trancriptional-Regulation.
החיידק צריך גם rRNA וגם tRNA כדי לשעתק, ולכן הוא משעתק אותם מאותו Pre.
לאחר השעתוק יש תהליכים שמטפלים בRNA בכל מיני רמות (שינוי בסיסים, מתילציה ועוד..)

Processing of tRNA

לעתים tRNA מפוזר בגנים, ולא תמיד נמצא בריבוזום. יש אנזימים שיכולים לחתוך אותו ולבצע בו שינויים. RNAse-P למשל הוא חלבון מסוג Rybozyme - אנזים שהוא RNA. בחלבון הזה, הRNA הוא זה שעושה את הפעילות הביוכימית ולכן הוא מיוחד. לPre-tRNA יש כמה חלקים שצריכים לקצוץ לפני שהוא לובש את צורתו הסופית.

DNA Degredation

עבור גנים חשובים מסוג Housekeeping, יש צורך לסנתז RNA כל הזמן. לכן, צריך תגובה מהירה של התא (רגישות גבוהה) למתרחש מסביב, כדי שהתא לא ייצר הרבה יותר ממה שהוא צריך.
זמן מחצית החיים של RNA הוא כ2-3 דקות. גופיפים שנקראים Processing bodies, או P-bodies הנמצאים על המיקרוטובולים, מפרקים מולקולות של mRNA.

אאוקריוטים

רוב הגנום שלנו מורכב מDNA שאינו מקודד.
גן מוגדר, בין היתר, כרצף שמקודד לRNA כאשר יש לו רצף בקרה מאחוריו.
פלסטר - צבר של גנים שחוזרים אחד אחרי השני. בגן של rRNA יש רצף שחוזר על עצמו פעמים רבות. גנים של היסטונים (חלבונים שאחראיים על מבנה ודחיסות הDNA) מופיעים גם הרבה פעמים בגנום.
Non-Coding DNA - דנ"א שלא מקודד לרנ"א. אצל חיידק ה E-Coli רוב הDNA משמש ליצירה (מקודד) מכיוון שהוא קטן. דוגמא לDNA שחוזר על עצמו היא Satelite-DNA. כאשר מסרכזים אותו, מוצאים שרוב הDNA נמצא באזור מסויים במבחנה, ויש חלקים נוספים, חלקי הSatelite שנתגלה שכ10%-20% מרצפים אלו היו עשירים בבסיסים A וT. רצף לא מקודד זה, ניתן למצוא בצנטרומר (מקום מפגש המיקרוטובולים).
כדי ליצור את הצנטרומר, צריך מבנה מתאים בDNA, שאותו נותנים האזורים בDNA שחוזרים על עצמם.

תהליך הספליסינג (Splicing)

אקסונים - חלקים מקודדים.
אינטרונים - חלקים לא מקודדים.
לאחר שנוצר Pre-mRNA, עליו לעבור הבשלה. הספלייסוזום חותך ממנו את האינטרונים ומדביק שוב את האקסונים לmRNA בוגר. הmRNA הבוגר עובר Export מהגרעין לציטופלסמה ובהמשך מקודד לחלבון.

Alu Elements - חתיכות DNA שיודעות לקפוץ בגנום. חתיכה שנכנסת ממקום אחד עוברת למקום אחר. תופעה זו קיימת אצל קופים ובני אדם.
הגנום עובר שינויים (דינמי) - Alu יכול לקפוץ לחלבון ולהיות חלק מקודד ממנו. 10% מהגנום שלנו הם Alu, כלומר יכולים להשתנות.

בגרעינון מתקבצים הrDNA, שהוא בית חרושת לrRNA. לDNA אנחנו קוראים גם כרומטין.
הטרוכרומטין הוא DNA דחוס מאוד בקצה הגרעין. מסדרים אותו בעזרת ההיסטונים, שטעונים חיובית (הDNA טעון שלילית).

ביוכימיה - הרצאה (12.2.08)

2008-02-23T07:11:00.000-08:00

שיעור #6

קיימים 3 הבדלים עיקריים בין הכפלה לשעתוק:

הRNA מורכב ומיוצר כגדיל אחד, לעומת הDNA שנמצא במצב דו-גדילי.
בהכפלה יש צורך להכפיל את כל הגנים, ואילו בתהליך השעתוק רק חלק מסויים.
בהכפלה יש צורך בדיוק מירבי, מכיוון שהחומר הגנטי המוכפל עובר לתאים חדשים.

בתהליכי השכפול ושעתוק הDNA קורות טעיות, ביחס של 1:1,000,000,000.
בRNA לעומת זאת, יחס הטעויות הוא כ 1:10,000.
mRNA - רנ"א שליח, או Messenger-RNA, הוא החלק שמקודד לחלבון ומהווה כ5% מהRNA בתא.
הtRNA אחראי להביא חומצות אמינו מתאימות בכל פעם לRNA.
rRNA - רנ"א ריבוזומלי מהווה חלק גדול מאחוז הRNA בתא.
Small RNAs - מולקולות RNA קטנטנות שמבקרות את פעולות הRNA בתא.

תהליך השעתוק מתחלק ל3 חלקים:

תחילת השעתוק (Initiation) - הRNA-פולימראז "מתיישב" על הגן הספציפי שאותו הוא משעתק.
ההכפלה, או ההארכה (Elongation) - התהליך עצמו בו הDNA מתארך.
סיום, טרמינציה (Termination) - סוף התהליך, בו השעתוק מסתיים (כיצד "יודע" הRNA מתי ואיך לעצור?)

שלב ההתחלה ושלב הסיום הם תהליכים מבוקרים.
בשנות השישים גילו לראשונה את מולקולת הRNA. מאוחר יותר גילו את מולקולות הריבוזומים ואת הmRNA.

גלקטוז וגלוקוז הם שני חומרים שהחיידק יודע לפרק ולנצל עבור אנרגיה. את הלקטוז החיידק מפרק בעזרת האנזים
β-גלקטוסידאז (קיימים עוד 2 אנזימים שמופרשים). האנזים הזה אינו מיוצר בכמויות גדולות אצל החיידק גם כאשר יש לו שפע של גלוקוז, אך כאשר יש לחיידק הרבה לקטוז, יש ייצור המוני של האנזים. מכאן הסיקו חוקרים, שהחיידק מגיב לשינויים סביבתיים ולפיכך יכול לשפעל או לכבות גן בהתאמה.
קיימת בקרה (או סיגנל) שגורם למולקולה מתווכת להעביר את הסיגנל הזה. המולקולה הזו מופיעה כשיש צורך ונעלמת כאשר אין יותר צורך בתהליך.

בניסוי שנערך נבדקו מס' מקרים בהם החיידקים מגיבים לסביבה:

מוטנט שגדל במצע ללא גלוקוז גורם לביטוי הקבוע של האנזימים המופרשים ללא קשר למצע עליו גדל החיידק.
חיידקים, שכאשר מוסיפים להם למצע לקטוז אינם מייצרים את האנזימים. (Non-Inducible)

מתוך כך הסיקו שקיימת מולקולה שמעבירה אות וכך מעכבת (Repressor) בשעת הצורך ומבקרת את ביטוי הגנים.
כאשר יש mRNA שצריך לקודד לחלבון, מולקולת הרפרסור גורמת לכך. אזור הקשירה של הרפרסור לDNA נקרא אופרטור (Operator).
לחיידקים יש אופרון (Operon) - יחידה בגנים שבה יש מספר גנים אחד ליד השני ברצף מיד לאחר רצף האופרטור.
בשלב הInitiation, הרפרסור יוצר mRNA שמקודד לחלבון רפרסור שמסוגל להצמד לאופרטור, וכך עוצר את
הRNA-פולימראז מלהצמד אליו ולסנתז אנזימים או חלבונים. כאשר הלקטוז נכנס למערכת, הוא נקשר לרפרסור ומשנה את המבנה שלו, ואז האופרטור חשוף לפעילות RNA-פולימראז, ואנזימים יכולים להיות מסונתזים ברצף האופרון.

בניסוי שבו התגלה הmRNA, הודבקו חיידקים בבקטריופאג' מסוג T2 השולט על החיידק, והוא החל לייצר RNA וחלבונים משל עצמו.
בשיטת Pulse Labelling (שיטה לזיהוי נוכחות מולקולות, בעיקר רנ"א שליח) השתמשו באיזוטופ P32, המסמן מולקולות DNA שהוכנסו לתאים. לאחר זמן מה הוציאו את החומר וראו כמה מולקולת רדיואקטיביות הוכנסו לתאים.
בניסוי עם RNA בחיידקים מדדו את כמות ה RNA שקיימת בתא, ומצאו שיש בעיקר 23s ו- 16s, שהן מולקולות RNA ריבוזומלי.
כשביצאו את הניסוי עם S ראדיואקטיבי ומדדו CPM, מצאו הרבה מולקולות RNA כתוצאה מהדבקת הבאקטריופאג'.
(CPM = Counts Per Minute) מולקולות אלו היו mRNA. מאוחר יותר התגלה שהן נוצרו ע"י הוירוס.

RNA-פולימראז

האנזים RNA-פולימראז יושב על הDNA, מפריד את שני הסלילים ומוסיך נוקליאוטידים טרי-פוספטים. הוא עובד בכיווניות 5' ל3'. אין צורך בפריימר - הוא מתחיל לעבוד מיד אחרי שהוא מתיישב על הDNA.
הגדיל הנגדי, המקודד, נקרא Sense (Coding) Strand.
הגדיל השני נקרא Anti-Sense (noncoding) Strand.
בחיידקים יש רק סוג אחד של האנזים הזה - RNAP, (או RNA-פולימראז-1).
ביצורים אאוקריוטים יש RNA-פולימראז-1, 2 ו3 שמייצרים rRNA, mRNA, ו-small RNAs.

ריפמיצין הוא חומר שמפסיק שעתוק של RNA אצל חיידקים ע"י עיכוב תת יחידה בטא של RNA-פולימראז. הוא לא עובד על RNA-פולימראז אצל יצורים אאוקריוטים.
אלפא-אמניטין הוא חומר שמעכב RNA-פולימראז אצל יצורים אאוקריוטים (בני אדם..). ברמות שונות, החומר יכול לעכב RNA-פולימראז שונים.
Cordycepin - חומר שגורם להפסקה של שעתוק בתאים. הוא דונה לאדנוזין (A), אך במקום 3'-OH, יש לו H ולכן הוא גורם לטרמינציה בשעתוק.
אקטינומיצין D - חומר שמעכב שעתוק (חזק מאוד). הוא נכנס לDNA ומתחבר אליו וסותם את ה minor groove.
ע"י כך הוא חוסם א הRNA-פולימראז ולא מאפשר לו לשעתק.

ההכפלה נעשית מהר, אך במעט מקומות בתא מכיוון שכמות הDNA-פולימראז-3 קטנה (כ10 מולקולות בתא בלבד).
קצב ההכפלה הוא כ 500-1000 נוקליאוטידים לשניה.
קיימות 3000 מולקולות RNA-פולימראז בתא, אך קצב העבודה שלהן איטי יותר - כ50 נוקליאוטידים לשניה.

RNA-פולימראז בפרוקריוטים
המולקולה העיקרית שמבצעת את תהליך השעתוק מורכבת מ2 תת-יחידות - אלפא ובתא (α, β). חלק זה נקרא Core-Polimerase. פקטורים נוספים יכולים להקשר אליו, כמו פקטור סיגמא.
פקטור סיגמא (σ) מקנה לאנזים את היכולת למצוא מקום ממנו הוא יוכל להתחיל לשעתק.
תהליך ה Scanning הוא בדיקת הDNA כדי למצוא פרומוטור, רצף בקרה שמצוי לפני כל תחילת גן. הפולימראז מתיישב על הפרומוטור, נצמד אליו כקומפלקס סגור ומתחיל לפרום את שני הגדילים. 8-9 בסיסים אחרי שהתהליך התחיל, עוזב פקטור סיגמא את הפולימראז, וזה ממשיך לעבוד עד סיום שעתוק הגן הרצוי, שם הוא עוצר.

מושגים
Upstream - האזור שמצוי לפני הגן עצמו.
Downstream - האזור שמצוי אחרי הגן. הנוקליאוטיד שממנו מתחיל התרגום הוא 1+.
Unwinding - פתיחת הDNA. האזור הפתוח הוא באורך של כ180 bp.
אצל חיידקים הנוקליאוטיד הראשון 1+ הוא בד"כ פורין (A או G).
UTR - אזור לא מתורגם (Untranslated Region). יכול להיות גם אזור בקרה.
Abortive Initiation - לפעמים הRNA-פולימראז מייצר מס' קטן של בסיסים, אבל מסיבה כלשהי התהליך לא עובד, והוא מפסיק, חוזר למקום ההתחלתי ומתחיל שוב את התהליך.
Active Site - האזור הפעיל באנזים בו מתרחשת תגובה ביוכימית. בRNA-פולימראז יש 2 יונים של MG+2 מהאתר הפעיל.
טופואיזומראז-1 - אנזים שמשחרר לחץ מאחורה.
טופואיזומראז-2 (נקרא גם גיראז, Girase) - משחרר לחץ מקדימה.
RNA-פולימראז משתהה לפעמים ומסוגל לחזור אחורה (Backtracking). כאשר הוא עושה זאת, גם פתיחת הDNA צריכה לחזור כמה שלבים אחורה. עדייו לא ברור מדוע זה קורה.

הפולימראז יכול לעשות "סליידינג" (Sliding) - להתעלם מהזנב שכבר נוצר ולהמשיך ליצור שוב.
יש אנזימים שחותכים את הזנב הקטן, ואז הוא מתחיל לשעתק שוב מההתחלה.
בrRNA יש חזרה של ייצור של יותר מRNA אחד בו זמנית.
בmRNA יש ייצור בודד (כאשר צריך).

Housekeeping Genes - גנים שמשועתקים בקצב קבוע, ללא קשר או תלות בגורמים חיצוניים והסביבה.
Inducible Genes - גנים שמשועתקים רק בשעת הצורך.
Concencus Sequence - רצף שכמעט תמיד מכיל את אותו רצף הפרומוטור. כאשר בחנו את האזורים הללו, מצאו אזורים דומים שפקטור סיגמא יכול לזהות.

בתהליך הטרמינציה (Termination) יש שני חלקים:

מבנה שניוני של RNA, Stemp Loop, גורם לפולימראז להשתנות. הRNA פולימראז אז יוצא ממקומו.
פקטור רהו (Ρ) - מולקולה שיוצרת טבעת, מתלבשת על הRNA ומחילקה עליו, מגיעה עד האזור שבו הפולימראז מחובר לRNA. היא פורמת את הקשר DNA-RNA, הם נפרדים והRNA-פולימראז נופל. תהליך זה מתרחש גם, ככל הנראה, באזורים שבהם האנזים משתהה.

ביוכימיה - הרצאה (10.2.08)

2008-02-16T10:35:00.000-08:00

שיעור #5

DNA-פולימראז-2 מעורב בתהליכי תיקון DNA.
ככל שהטלומר (הרצף בקצה הDNA) ארוך יותר, כך התאים יכולים להתחלק יותר פעמים.
אצל בני אדם רצף הטלומר נראה כך: TTAGGG. אצל יצורים אחרים הרצף שונה מעט, אך קיים דמיון.

במשך שנים רבות הייתה הנחה שוירוסים מסויימים יכולים לגרום לסרטן ע"י שיבוש חלוקה של תאים.
החומר התורשתי של הוירוסים הללו היה RNA חד-גדילי, והחוקרים לא הבינו איך וירוסים משבשים פעילות DNA בתאים של בני אדם ואיך הגנום שלהם עובר אינטגרציה עם זה שלנו.
חוקר בריטי טען שהצליח לבודד אנזים שמסוגל לבצע פעולה הפוכה בוירוסים אלו - הפיכת RNA לDNA. לאנזים הזה קוראים DNA-Reverse-Transcriptase.
בקצוות הRNA יש רצפים משלימים. בשלב הראשון, אנזים משתמש במולקולת tRNA כפריימר כדי להשלים את הקטע החסר על לקצה של הגנום הלינארי.
בשלב הבא, האמזים RNAse-H מפרק RNA שנמצא בזיווג עם נוקליאוטידים משלימים עם מולקולת DNA. מוצר DNA ללא גדיל משלים, והוא עובר התעגלות. מתקבל מבנה של RNA ויראלי, עם DNA שיוכל לעבור הכפלה.
בעזרת יצירת גדיל נוסף יתקבל DNA משלים, וכך נוצר DNA דו גדילי שיכול לעבור מהוירס לגרעין התא של האורגניזם, ואף יכול לעבור אינטגרציה עם הגנום של הנדבק.
אצל נשא, ביטוי הDNA אינו גורם למחלה באופן ישיר.

פרק 25 בספר הלימוד - ארגון מחדש של האינפורמציה בDNA
אפיגנטיקה - נושא העוסק במידע נוסף, מעבר לזה שנמצע ברצף הנוקליאוטידים.
DNA מסוגל לעבור מתילציה - דבר הגורם לתא להתייחס לאינפורמציה בגן בצורה שונה.
חלבונים של כרומטין גם יכולים לבקר את האינפורמציה שמקודדת ע"י הDNA.

להלן מספר מושגים חשובים:
מודיפיקציה - שינויים אפיגנטים של הDNA.
רקומבינציה - שחלוף. במיוזה המתרחשת בתאי מין יש שחלוף מידע בין שני תאים ליצירת DNA שונה.
אמפליקציה - קטעים של DNA המוכפלים הרבה פעמים.
ארגון מחדש (Rearrangement) - קשור ליכולתו של הגוף ליצור נוגדים נגד כמעט כל פולש.
מתילציה - קישור קביצת מתיל לDNA. יכולה להתרחש רק לאחר שמולקולת DNA נוצרה.
מתילאזות - אנזימים שקושרים מתיל לDNA.

אצל חיידקים, המתילציה מתרחשת על החנקן שקשור לפחמן 6 של מולקולת האדנין. מולקולת המתיל נקשרת רק לאחר שהDNA נוצר. החנקן שקשור לפחמן 4 (מתיל ציטוזין) גם עובר מתילציה.
מתילציות מסוג זה נפוצות\ידועות אצל חיידקים והן נחשבות נורמליות או פיזיולוגיות.
המתילאזות מעורבות בתהליכי תיקון DNA. חלק ממנגנון התיקון של השברים בDNA קשור לתהליך מתילציה, בעיקר על אדנין. המתילציה גם מעורבת בתהליך תיקון DNA ובבקרה על השכפול והשעתוק. אצל חיידקים תהליך זה מגן על חיידק מפני פולשים, כמו וירוסים. במקרים מסויימים, חיידק הסלמונלה למשל, מתילציה גורמת לו להיות אלים יותר.
לגבי תאים אאוקריוטים - הנוקליאוטיד היחיד שעובר מתילציה במצב פיזיולוגי הוא הציטוזין. 5-מתיל-ציטוזין, על פחמן 5. בתאים של יונקים, ציטוזין שעבר מתילציה נמצא 5' לשייר של גואנין (G), כלומר, G נמצא מייד אחריו.

בתאים אנימליים:

DNA String: '3 CpG '5

P מסמן את הפוספט של הגואנין.
בתאים צמחיים הרצף יהיה:

DNA String: '3 CpNpG '5

N מסמן נוקליאוטיד כלשהו (לא משנה איזה נוקליאוטיד)

תבנית המתילציה של DNA נשמרת גם לאחר חלוקת התא. לאחר הכפלת הDNA, מתילאזות מוסיפות את המתיל על הגדיל המשלים במקום בו הייתה מתילציה לפני ההכפלה.
יש גנים שבהתפתחות העוברית מבוטאים ברמה גבוהה, אך לאחר הלידה הם מושתקים עד יומו האחרון של האורגניזם.
המוגלובין עוברי למשל, מפסיק להווצר לאחר הלידה ובמקומו מתחיל להווצר המוגלובין אחר.
5-Azacytozine הוא ציטוזין שלא יכול לעבור מתילציה, אך פרט לעובדה זו הוא זהה לציטוזין רגיל.
אם ההשתקה היא בגלל מתילציה, לאחר מספר חלוקות לא נצטרך יותר להשתמש בו, ואם הגן היה מופעל אז נדע שהמתילציה היא זו שגרמה להשתקה.
באמת ראו שהגנים שחשבו שמעורבים בבקרה של ביטוי החלו להתבטא, וכך אנו יודעים שמתילציה מעורבת בבקרת ביטוי של גנים.

האנזים מתילאז לוקח את קבוצת המתיל מהמולקולה Adomet ומלביש אותה על הציטוזין.
Genetic Imprinting - תהליך שבו אלל שמועבר מאחד ההורים יהיה משותק ע"י מתילציה, והאלל מההורה האחר יהיה פעיל.
בגמטות של זכר, יש מצב של דמטילציה - למרות שהאלל האימהי ממותל, בגמטות יש תהליך של הסרת המתיל, ולכן כל תא זרע שהזכר יתרום יהיה לא ממותל, והאלל הלא ממותל יהיה פעיל בדור הבא. אצל הנקבה המקרה הפוך.
קיים גם תהליך Imprinting הפוך, שבו האלל של האב מושתק, והאלל של האם מבוטא.

אם על גבי צלחת חיידקים נוסיף בקטריופאג'ים בכמות קטנה, כעבור זמן מה נקבל "פלאקים" - אזורים ריקים בתוך מרבד חיידקים. הפלאקים הם למעשה אזורים שבהם החייקים עברו ליזיס (פירוק).
Arber לקח בקטריופאג' וחיידקי E-Coli, ולקח חיידקים מתוך הפלאק והדביק אותם בצלחת חדשה.
חיידקים מזן B ידעו להתגונן מפני הפאג'ים, ואילו חיידקים מזן K הודבקו ע"י הבקטריופאג'.
לפי סוג החיידקים נוצרו פלאקים ברמות שונות, ומכך הסיק Arber שלחיידק יש מנגנון הגנה מפני פולשים חיצוניים.
אנדונוקליאזות (נקראים גם "אנזימי רסטריקציה" - מפרקים DNA) מזהים רצפים ספציפים, למשל, רצף GAATTC יפורק ע"י החיידק.
על הDNA העצמי של החיידק הוא מגן בעזרת מתילציה. אם חלה טעות והחיידק גורם לוירוס מתילציה, הוירוס יהיה עמיד בפני האנדונוקליאזות.
אנזימים אלו, מגבילים את הDNA שיכול להיות בתוך התא. הם יצרו מהפכה במחקר הביולוגי - חלק גדול מההנדסה הגנטית מבוססת על התגלית שלהם.

בעזרת האנזים ECO-R1 אפשר לחתוך פלסמיד האזור מסויים. לפני מספר שנים השתמשו באינסולין של חזירים כדי להזריק לחולי סוכרת, אך זה לא תמיד עבד, ולעתים אף גרם למוות.
בעזרת אנזים זה, ניתן לחתוך גן של אינסולין במקום שמייצר אינסולין וכך להעביר אותו לבני אדם חולי סוכרת.
הטכנולוגיה של שימוש באנזימי רסטריקציה היא הבסיס להנדסה גנטית!
לכל אנזים רסטריקציה יש רצף DNA שהוא מכיר. יש גם אנזימים כאלו שמכירים רצפים המכילים מתיל.

ביוכימיה - הרצאה (5.2.08)

2008-02-16T08:44:00.000-08:00

שיעור #4

האנזים DNA-פולימראז מאריך את הפריימר. הגדיל שמתחיל מקצה 5' מוארך, והוא הגדיל המוביל.
הגדיל השני (ה Lagging Strand) משוכפל מקטעים-מקטעים (ע"י פריימרים של RNA) והאנזים הליקאז ממשיך לפתוח אותו וכך גם הוא מוארך.
קיים תהליך של סילוק פריימר הRNA, החלפתו בפריימר DNA והשלמת הרווחים בין הפריימירים שהוחלפו.
השעתוק והשכפול של שני הגדילי מבוצעים ע"י האנזים DNA-פולימראז-3.
DNA-פולימראז-1 מבצע את סילוק הפריימרים של הRNA והשלמת הרווחים.
בתהליך זה, באה לידי ביטוי פעילותו של DNA-פולימראז-1: קצה ה 5'-אקסונוקליאז משמש כ Nick-Translation.
הDomain הC-טרמינלי הוא בעל יכולת הProof-Reading, כלומר בודק אם הוכנס הנוקליאוטיד הנכון (הDNA נכנס לחריץ בחלבון רק אם הנוקליאוטיד האחרון שהוכנס שגוי, והוא מתוקן).
האנזים מסלק בעזרת ה5'-אקסונוקליאז את ה5' של הRNA ובמקומו קושר מקטע DNA לשרשרת במקום 3'.
בסופו של דבר, DNA-פולימראז-1 מחליף את כל הRNA בDNA.

לDNA-פולימראז-3 אין ממש פעילות של 3'-אקסונוקליאז. הוא מכיל 10 פוליפפטידים שונים.
תת היחידה ε (אפסילון) היא זו שמקנה לאנזים את יכולת הק'-אקסונוקליאז.
תת היחידה θ (טטה) - לא ברור בדיוק מה תפקידה.
תת היחידה ρ (רהו) משמשת כDomain ומקשרת בין שתי תתי יחידות פונקציונליות, ומאפשרת שכפול בקצב אחיד עבור שני הגדילים.
תת היחידה β (בטא) אחראית לכך שהProcessivity של הDNA-פולימראז-3 גבוה כל כך. היא מקיפה את הDNA בטבעת, וכך גם מונעת ממנו תזוזה בלתי רצויה. כל האזורים שפונים כלפי פנים הטבעת הם הידרופוביים, ומכיוון שהDNA גם הוא הידרופובי, הוא נשאר בטבעת.
תת היחידה χ (חי) בעלת מס' תפקידים - אחד מהם הוא לבצע התאמה בין חומצות האמינו.
שלוש תת יחידות נוספות, γ (גמא), δ (דלתא) ו- ψ (פסי) "טוענות" את הטבעת על הDNA.
כשמולקולת ATP נקשרת לאחת מהן היא גורמת לשינוי קונפורמטיבי בקומפלקס הזה. הפתיחה של הטבעת מתבצעת ע"י הקישור של תת היחידה γ לקומפלקס β. כאשר מולקולת DNA נכנסת לטבעת, מתבצעת הידרוליזה של ATP לADP, נגרם שינוי קונפורמטיבי, הקומפלקס עוזב את תת-היחידה β, והיא עוזבת. האנזים הכולל עכשיו קשור למולקולת הDNA בעזרת הטבעת ותהליך השכפול יכול לצאת לפועל.

על הגדיל המוביל (Leading Strand) מספיק לטעון את הטבעת פעם אחת בלבד בכדי לאפשר סינתוז שלו באופן רציף.
על הגדיל המשלים (Lagging Strand) יש צורך לטעון את הטבעת על כל מקטע אוקזקי שנוסף.
המסקנה העולה מכך היא, שגם לאנזים DNA-פולימראז-3 יש יכולת Proof-Reading.
השלב האחרון הוא חיבור מקטעי האוקזקי (כלומר לאחר שכל מקטעי הRNA הוחלפו בDNA).
האנזים DNA-ליגאז הוא זה שמבצע את חיבור מקטעי הDNA בתנאי שבקצה הק3' יש הידרוקסיל על-גבי פחמן מס' 3 של המולקולה, וקיים פוספט על קצה ה5'.
אם לפוספט-α לא הייתה אפשרות של מעבר האלקטרון, הקשר לא יכול לצאת לפועל.
ה DNA-ליגאז עובר אקטיבציה ע"י קישור של אדנין-מונופוספט. כשהליגאז נקשר לאזור השבר מתבצעת התקפה נוקליאופילית ומתקבל קשר פוספודיאסתרי.

ביצורים פרוקריוטים (חיידקים למשל):

טופואיזומראז - (מקבוצה TYPE-1) אנזים זה משחרר את המתח שנוצר על הסליל וסוגר את הגדיל שוב.
קבוצת TYPE-2 פותחת את הלולאה ומפרידה ממנה את מולקולת הDNA. לאחר מכן היא סוגרת את שני הגדילים בחזרה. משפחה זו של אנזימים פועלת גם על DNA מעגלי - האנזימים האלו אחראיים על שחרור קשרים מסובכים יותר כדי לשחרר לחץ.

ביצורים אאוקריוטים:

DNA-פולימראז-α אחראי על יצירת מקטעי אוקזקי.
DNA-פולימראז-1 מקושר עם הפרימאז. הפרימאז מייצר עבורו את הפריימר וכך הוא יכול להמשיך לשעתק.
DNA-פולימראז-β מעורב בתהליכי תיקון DNA. אצל חיידקים, DNA-פולימראז-2 מעורב גם כן בתהליכי תיקון.
DNA-פולימראז-γ אחראי על הכפלה של DNA-מיטוכונדריאלי. בחיידק אין מיטוכונדריאה ולכן אין לו אנזים מקביל.
DNA-פולימראז-δ אחראי על שכפול הגדיל המשלים.
DNA-פולימראז-ε הוא בעל תפקיד לא ברור...

לDNA-פולימראז-δ יש Processivity נמוך, אולם כאשר מחברים לו את הטבעת עם תת-היחידה β היעילות שלו עולה הצורה ניכרת.
ה ( PCNA - (Proliferating Cell Nuclear Antigen משמש כסמן לתאים מתחלקים במקרים רבים, כי רק תאים מתחלקים מכפילים את הDNA שלהם. הוא מגדיל את היעילות ומשמש כProcessivity-Promoting Factor.

האזור האחרון של הפריימר בDNA לינארי מהווה בעיה להשלמה מכיוון שאין עוד חלק לפניו.
בDNA של בקטריופאג', בקצוות 3' וגם 5' יש רצפים שחוזרים על עצמם והם משלימים. שני הקטעים נצמדים ומושלמים ע"י רצף משלים. בזמן השכפול כל וירוס מקבל עותק של כל הגנים.

במודל אחר, השייך לאדנו-וירוס נעשה שימוש בחלבון Terminal-Protein המשמש כפריימר מחוץ לDNA עצמו.
הוא משכפל גודל אחד בשלמותו ומורחק מהDNA. הגדיל הזה, בעל קצוות משלימים, עובר לצורה טבעתית, ובעזרת אנזים פריימר הוא עובר השלמה לגדיל משלים.

קיים מנגנון שמגביל את מספר הפעמים שניתן לחלק תאים. אצל בני האדם, בכל כרומוזום יש קומפלקס שנקרא "טלומר". בטלומר יש רצף DNA שחוזר על עצמו הרבה פעמים. האנזים טלומראז (סוג של DNA-פולימראז) מכיל בתוכו נוקליאוטידים ומוסיף בקצה 3' רצף שחוזר על עצמו פעמים רבות. רצף הטלומר שנוסף אינו מקודד ולכן אינו חשוב, כך שניתן "לקצץ" אותו.
אם לאחר מספר כלשהו של חלוקות תאים התקצר כל רצף הטלומר, מידע מקצה הDNA יאבד, מה שייגרום בסופו של דבר לאיבוד חלק מהגנים ולמוות של התאים. לכן, אורך החיים של התא, תלוי ברצף הטלומר.
קיימת השערה שלפיה הארכת רצף הטלומר יכולה להאריך חיי אדם.
הטלומראז פועל בשלב העוברי או בתאי גזע במוח העצם. לאחר השלב העוברי הוא מושתק.
הוספה בלתי מבוקרת של טלומראז עלולה לגרם לסרטן מכיוון שהוא ממשיך להאריך את רצף הטלומר, מה שגורם לחלוקה כמעט אינסופית של תאים.

ביוכימיה - הרצאה (3.2.08)

2008-02-14T08:56:00.000-08:00

שיעור #3

DNA יכול להמצא בצורת ADNA, BDNA ו-ZDNA. מולקולה היברידית (מורכבת מRNA ו-DNA) תהיה בצורת ADNA ותמצא בסביבה מיימית. מבנה של BDNA מתאפשר כאשר החמצן על גבי פחמן 2 חסר. מבנה הZDNA מאופיין ע"י סיבוב הפוך (שמאלי), והפורינים שלו במצב SIN במקום ANTI, מה שמאפשר מתילציה היעילות גדולה יותר. בצורת ה HDNA, ניתן לקבל סליל משולש, או תלת-גדילי. הסיבה לכך ששני הגדילים של הDNA נשארים צמודים זה לזה היא שה-ΔH גדל טובת דנטורציה. ובכל זאת, יש לנו קשרי מימן שתורמים ΔH גדול יותר, מה שגורם ל ΔG להיות חיובי. קשרי המימן הם אלו שמייצבים את המבנה הדו-גדילי בשתי דרכים:

העלאת הטמפרטורה תורמת ל ΔG שלילי. היא יכולה לגרום להפרדה בין שני הגדילים, ומתוך כך לדנטורציה.
הקטנת החוזק היוני של התמיסה או הוצאת המלח מהתמיסה תתרום לדנטורציה מכיוון שפרמטר הדחייה יגדל.

שכפול DNA

הDNA בגרעין יכול לעבור שכפול ע"י הפרדת הגדילים (הכפלה קונסרטיבית), שעתוק לmRNA, t-RNA או מיקרו-RNA. יצירת המולקולות RNA על בסיס הDNA נקראת שעתוק או תעתוק (Transcription).
מולקולות אלו יוצאות מגרעין התא לציטופלסמה. במהלך השעתוק נוצרות מולקולות RNA, כאשר כיווניות יצירת הRNA היא תמיד מכיוון קצה 5' לכיוון 3' - הנוקליאוטיד החדש תמיד יתווסף בקצה של 3'.

הRNA-פולימראז פותח את הסליל הכפול, וריבונוקליאוטידים מתווספים עד שמולקולות הmRNA והtRNA יורדות. בסוף, מולקולת הmRNA יוצאת לציטופלסמה ומתורגמת לחלבון.
הריבוזום סורק את מולקולת ה mRNA עד שמגיע לקודון ההתחלה "AUG". אז מגיע tRNA עם חומצה אמינית אחרת מתאימה לבניית החלבון. החלבון תמיד נוצר מהקצה הN-טרמינלי לכיוון הקצה הC-טרמינלי.

תהליך שכפול הDNA קורה ב-3 שלבים עיקריים:

התחלה (Initiation)
שכפול (Chain elongation)
סיום (Termination)

שכיחות המוטציות בתהליך השכפול נמוכה מאוד - קיים מנגנון המונע זאת. ישנה מוטציה "שקטה", אך מוטציה יכולה גם להיות מסוכנת ולשנות פעולה של חלבון בכמה דרכים. קיימת גם מוטצה טובה, חיובית שמקנה לאורגניזם יתרון - זו אחת התיאוריות של האבולוציה.
מערכות הדם, המין (אצל הזכר) והעור משכפלות תאים. התא צריך לדעת לסנכרן בין שכפול התא לבין שכפול הDNA.

מחקר שנערך על חיידק ה E-Coli בוצע על מנת להבין כיצד מתבצע התהליך.

קצב השכפול הוא 850 נוקליאוטידים לשניה. אצל יונקים הקצב הוא 60-90 נוקליאוטידים לשניה.
בDNA של חיידקים (DNA מעגלי) השכפול מתחיל מנקודה אחת. אצל בני אדם (DNA לינארי) יש עשרות עד מאות Origin of Replication, והשכפול מתבצע בו-זמנית מכמה נקודות.
מחזור חלוקה של חיידק הוא כ-20 דקות, ומחזור שכפול DNA הוא כ-40 דקות.

השכפול מתחיל ע"י הפרדה בין 2 הגדילים, שיוצרת מזלג הכפלה.
בהנחה שהשכפול מתבצע בכל גדיל בו-זמנית, הכיוונים הפוכים.
לקחו DNA מעגלי (הנמצא בחיידקים, וירוסים ובקטריופאג'ים) בזמן ההכפלה ובדקו את זמן ההתחלה והסיום של התהליך. לקראת סיום ההכפלה, הוסיפו למצע החיידקים נוקליאוטידים המסומנים בטרידיום (איזוטופ של מימן, H). אם ההוספה הייתה לקראת סיום ההכפלה ומעט לפני הכפלה חדשה, היה מתקבל אזור יחיד מסומן בDNA. אם ההכפלה היית ל-2 כיוונים היינו מקבלים 2 סימונים רדיואקטיביים.
ניסוי דומה נעשה על חיידק עם פלסמיד (DNA חוץ מעגלי, שאינו חלק מהגנום הכרומוזומלי של החיידק).
פלסמיד יכול לעבור אינטגרציה לתוך DNA הכרומוזומלי של האורגניזם, וכך להיות מוכפל ביחד עם הDNA המקורי, ואף להשתלב לצמיתות בDNA המקורי. פלסמיד שעבר אינטגרציה כזו נקרא אפיזום.
לפלסמיד יש Origin of Replication משל עצמו. קיים מנגנון שבו הOOR של האפיזום מושתק, והOOR של החיידק הוא זה שממנו מתחילה ההכפלה.
הOOR הוא תלוי רצף. ישנם רצפים מסויימים שאם נכניס אותם לתוך הDNA הם יתחילו מאותו OOR. רצף זה צריך להיות מוכר ע"י חלבונים ספציפיים.
בהרבה יצורים הצליחו לאפיין את הרצף ע"י הוצאת מקטע מתוך הרצף, וכתצאה מכך הOOR השתנה.
רצף הOOR מוכר ע"י חלבונים - הם נקשרים אליו ומגייסים את שאר החלבונים לתהליך השכפול.
בזמן החלוקה, הDNA כבר נמצא באמצע תהליך ההכפלה של המחזור הבא.
כאשר שני הגדילים פתוחים, מתחיל תהליך השכפול מכיוון 5' לכיוון 3' בגדיל המוביל (Leading Strand). בגדיל המשלים (Lagging Strand) יש שימוש במקטעי אוקזקי - הגדיל מייצר מקטע קצר בכל פעם.

האנזים DNA-פולימראז מאריך שרשרת קיימת של DNA. לשם כך, יש צורך באנזים נוסף, פרימאז (Primase), שמייצר פריימר מסוג RNA.
ב Lagging Strand נעשה שימוש בהרבה פריימרים, בכל פעם באזור ה5' של מקטעי האוקזקי. לכן, האנזים שפותח את הסליל, הליקאז (Helicase) צמוד לפרימאז.
פרימוזום (Primosome) הוא קומפלקס של פרימאז והליקאז.
על כל גדיל של DNA יש DNA-פולימראז. שני האנזימים האלו (אחד על כל גדיל) מחוברים גם הם בקומפלקס אחד, ולמרות שכל אחד מהם משכפל לכיוון נגדי, הם נעים לאותו כיוון של מזלג ההכפלה כדי שיוכלו לשכפל את שני הגדילים בקצב אחיד.

SSDBP - Single-Stranded DNA Binding Proteins

אחרי שאנזימי ההליקאז פתחו את הDNA, יש שני גדילים "עצמאיים". כדי למנוע את הצמדות הגדילים מחדש, צריך לייצב את המבנה החד-גדילי, ולאפשר קשרי מימן בין הנוקליאוטידים החדשים.
השכפול תמיד מתבצע מכיוון 5' ל3'. נוקליאוטיד חדש תמיד מגיע כ- טרינוקליאוטיד המתווסף לקצה 3'.
ה α-פוספט הוא הפוספט שקשור לקצה 5 של הסוכר.
בקצה ה3' יש קבוצת OH פנויה. אם אין כזו קבוצה פנויה, אי אפשר להאריך את השרשרת, כי כאשר נוקליאוטיד חדש מגיע עם GTP, הG מזהה את הC בעזרת SSDBP, ולאחר הזיהוי יש התקפה נוקליאופילית על הפוספט, והוא מוותר על האלקטרונים של הקשר, ויוצר קשר בין שני הנוקליאוטידים ע"י שחרור הדיפוספט, כך שקיבלנו תוספת נוקליאוטיד לשרשרת עם קבוצת OH פנויה נוספת.

לגבי ה Lagging Strand: הבעיה היא שצריך לסלק פריימרים של RNA. לאחר מכן, צריך להשלים את הפער עם דיאוקסינוקליאוטידים ולסגור את המולקולה.

שלושת האנזימים העיקריים בתהליך הם:
DNA-פולימראז-1: מקודד ע"י הגן פול-A
DNA-פולימראז-2: מקודד ע"י הגן פול-P
DNA-פולימראז-3: מקודד ע"י הגן פול-C

Processivity - מושג שמייצג את מספר הנוקליאוטידים שהאנזים יכול להוסיף למולקולה לפני שהוא נופל ממנו (או לפני שהוא מאבד את יכולת הפעולה שלו).
DNA-פולימראז-3 הוא האנזים בעל קצב העבודה הגבוהה ביותר מבין השלושה, ואצל חיידקים הוא מבצע את כל עבודת השכפול.
DNA-פולימראז-1 ממלא את הרווחים (Gaps) במקום הפריימרים של הRNA.
יש לו 3 פעולות שונות:

פעילות של DNA-פולימראז - הלבשת קצה על שרשרת DNA.
פעילות של 3'-אקסונוקליאז - בדיקה שהוכנס הנוקליאוטיד המתאים. אם הוכנס נוקליאוטיד שגוי, האנזים יחתוך אותו ויכניס נוקליאוטיד נכון במקומו. זהו מנגנון נגד מוטציות.
פעילות 5'-אקסונוקליאז - פעילות של חיתוך מולקולות מקצה ה5' של המולקולה.

בין שני מקטעי אוקזקי, יש אזור קצר בו הDNA לא מחובר. בנקודה זו נכנס הDNA-פולימראז-1 לפעולה: הוא מוריד את הנוקליאוטיד הראשון בפריימר של ה-RNA - הורדה של נוקליאוטיד מקצה 5', והוספת נוקליאוטיד לקצה 3'.

OOR* = Origin of Replication

ביוכימיה - הרצאה (29.1.08)

2008-02-14T08:03:00.001-08:00

שיעור #2

כידוע, הDNA מורכב מבסיסים ומשני גדילים. מבנה הDNA הוא מסולסל, בצורה כזו שהנוקליאוטידים בולטים החוצה ויוצרים "שקע" בDNA. ייתכנו שני סוגי שקעים כאלו:
שקע צר, הנקרא Minor Groove,
ושקע רחב, הנקרא Major Groove.
בכל עליה של שלב בסליל הDNA יש 10 בסיסים.
ההפרש בין כל עליה לעליה הוא הוא 3.4 ננומטר.
חלבונים שיוצרים אינטראקציה עם הDNA יכולים להקשר ל Major/Minor Groove בהתאם למרווח.

בניסוי של מזלסון וסטהל לקחו שני איזוטופים של חנקנים עבור שני מקרים.
DNA שהכיל חנקן N15 שקע בגראדיינט, ואילו הDNA הקל יותר צף למעלה.
ידעו שחיידקים מכפילים את עצמם כל 8 שעות, ומכיוון שהDNA שלהם היה צבוע, ראו שדם הDNA משתכפל בצורה כלשהי.

ישנן צורות שונות להסתלסלות הDNA, אך 3 הצורות העיקריות הן:

BDNA - יש 10 בסיסים לכל סיבוב. הכיווניות היא ימין.
ADNA - יש 11 בסיסים לכל סיבוב. הכיווניות היא ימין.
ZDNA - הכיווניות היא שמאל. (Left hand helix).

בתאים לא קיימות מולקולות בצורת ZDNA. למרות זאת, יש אזורים בDNA שהם עשירים בבסיסים G ו-C, וייתכן שאזורים אלו הם בצורת ZDNA או דומה לה. נקודות אלו חלשות יותר, ופחות יציבות.

טופואיזומראז - אנזים שתפקידו (או אחד התפקידים שלו) הוא לשחרר לחץ מסליל הDNA. הוא חותך (Nip) גדיל אחד, משחרר את הסלסול, ומחבר בחזרה. פעולה זו חוזרת על עצמה עד שמתקבלת מולקולת DNA עגולה.
טופואיזומראז 2 (נקרא גם DNA-Girase) - אנזים שחותך את שני הגדילים, ומעביר אחד דרך השני, בניגוד לטופואיזומראז שחותך רק גדיל אחד.
תהליך פתיחת הDNA כך שהDNA יהיה בסדר אקראי נקרא "דנטורינג" (Denaturing?)

מושגים נוספים:
Hoogsteen Base pair - צורה של זיווג בסיסים, המאפשרת זיווג של 3 בסיסים (3 גדילים), T-A-T, לדוגמא.

Supercoiled - מצב בו סליל הDNA מסולסל (מצב טבעי) ודחוס יותר.
Relaxed - מצב בו סליל הDNA בצורה מעגל, כאשר הוא אינו מסולסל (לאחר שאנזים שחרר בו לחץ ושינה את צורתו)
L-Linking Number - מס' הפעמים שבו סליל אחד של DNA מקיף\עוטף את הסליל השני.
T-Twist - מס' הפעמים שפולינוקליאוטיד מסתלסל סביב ציר הדופלקס.
W-Writhing Number - מס' הפעמים ששני הגדילים מסתלסלים סביב ציר הדופלקס ("סלסול שניוני").

ביוכימיה הרצאה - (27.01.08)

2008-02-08T08:24:00.000-08:00

שיעור #1

ספרי הלימוד עבור הקורס "ביוכימיה א'" הם:

1) Biolchemistry 3rd Edition - Mathews. Van Holde & Ahern

2) Fundamentals of Biochemistry - Voet. Voet & Pratt

עיקר ההבדלים בין תא פרוקריוטי לתא אאוקריוטי הם בגרעין, צורת ההעתקה, התרגום והשעתוק של ה-DNA, הגודל ועוד מס' הבדלים (לחזור על החומר משנה א').
סכימה של תהליך שכפול ה-DNA:

דנ"א --> רנ"א --> חלבון --> פעילות בתאים (Function)

קשרי מימן הם קשרים חלשים יותר מקשרים קוולנטים. הם מקשרים בין חומצות הגרעין בDNA וגם בין מולקולות מים.
אלו קשרים די חזקים, אך ניתן להפריד אותם והם מבוססים על מטען חשמלי.
יש כיווניות כלשהי בקשרים מסוג זה (Donor מול Acceptor) שבאה לידי חשיבות בעת פתיחת הקשרים בין הבסיסים.

בניסוי של Avery, Mcloeod & McCarty בשנת 1944 הצליחו לקבוע עובדה חשובה. הם העבירו חומרים מתוך גרעין התא, מתא פתוגני לתא שאינו פתוגני. מלבד הDNA הם העבירו גם חלבונים וחומרים אחרים, אך רק לאחר בדיקות מעמיקות, הם ראו שהתא שאינו פתוגני הופך לפתוגני רק אם הDNA מועבר אליו. מתוך כך הסיקו שהחלבונים אינם אלו שאחראיים על העברת הגנים, אלא החומר התורשתי, הDNA הוא שאחראי לכך.
כמה שנים מאוחר יותר, בשנת 1952 ערכו הרשי וקייס ניסוי משלהם (Hersy-Case Experiment) שקבע כי הDNA הוא החומר התורשתי של הפאג', ומעבר לכך, של כל האורגניזמים. לפני הניסוי, חשבו שהחלבונים הם החומר התורשתי של הוירוסים, ולא הDNA.
באקטריופאג' הוא וירוס קטן שמדביק באקטריה. הוא מכיל מעטפת חלבונים ובתוכה החומר הגנטי. בתהליך ההדבקה, הפאג' מחדיר את החומר הגנטי לתוך הבאקטריה, אך מעטפת החלבונים נשארת בחוץ.
נערכו שני ניסויים. בניסוי הראשון לקחו פאג' (מסוג T2) גידלו אותו על מצע של פוספט P32 כך שכל הDNA שלו היה מסומן רדיואקטיבית.
בניסוי השני גידלו פאג' על מצע של גופרית S35 שמסמן את החלבון בתא.
לאחר שראו שהחומר שעובר מהפאג' לבאקטריה הוא הDNA הסיקו מכך שזהו החומר הגנטי.

הDNA\RNA בנוי משלושה חלקים:
1) קבוצת הסוכר: בDNA לריבוז (הסוכר) חסר חמצן אחד שקשור לפחמן מס' 2, וכן גם הוא נקרא DNA - Deoxyribonucleic Acid.
2) בסיסים: פורינים הם A ו-G, והם מורכבים מ2 טבעות ארומטיות.
פירמידינים הם T ו-C (קטנים יותר בנפח) ובנויים כ"א מטבעת יחידה.
במולקולות הRNA הבסיס T מוחלף בU.
3) פוספט: שלד הDNA בנוי מקבוצות של סוכר-פוספט הקשורות אחת לשניה בשרשרת ארוכה.
קבוצה זומחברת את קבוצות הריבוז בעזרת קשרים פוספודיאסטרים בין פחמן '3 לפחמן '5. המבנה של הRNA זהה לזה של הDNA, אך הRNA מורכב מסליל אחד (חד-גדילי).

לכל מולקולת RNA או DNA יש 2 קצוות הנקראים '3 ו-'5 (3 פריים, ו-5 פריים)
חיבור של נוקליאוטיד לשרשרת DNA קיימת, נוצר בזכות אנרגיה הנוצרת כתוצאה משחרור של 3 מולקולות P מקבוצת הפוספט. מולקולות עתירות אנרגיה דוחפות את הריאקציה ליצירת DNA.

סיכום ביניים:

ריאקציה של DNA + נוקליאוטידים מתבצעת בעזרת אנזימים ואנרגיה.
ניתן לפרק DNA בעזרת חומצה חזקה או בסיס חזק, אך מדובר במולקולה יציבה מאוד שיכולה להחזיק מעמד שנים רבות.
RNA לעומתה היא מולקולה הרבה פחות יציבה. כיוון שתי המולקולות הוא מ'5 ל-'3.
חשוב לדעת כיצד אנזימים "קוראים" את הגן (בשיעורים הבאים).

המבנה השניוני של הDNA

המדענים המהוללים ווטסון וקריק, הם שהגיעו למסקנה שצורתו של הDNA היא מסולסלת ושהוא בנוי משני סלילים (דו-גדילי). יש הטוענים שעותק מיומנה של המדענית רוזלין פרנקלין, שהגיעה למסקנה זו שבועיים קודם לכן, מצא את דרכו לידיהם בצורה לא ברורה...
ווטסון וקריק גילו שכמות הבסיסים A ו-T שוות, וגם כמות הC וה-G שוות באותו הסליל, וכך הגיעו למסקנה שאלו בסיסים שמשלימים אחד את השני בהתאמה.
הם גיבשו מבנה של מולקולת DNA, וע"י שימוש בקרני X הם קיבלו את מבנה הDNA. תחילה הם בנו מודל המורכב מ-3 סלילים, אך מאוחר יותר הבינו שהDNA הוא מבנה דו-גדילי.
אורך הקשר בין A ל-T זהה לאורך הקשר בין C ל-G. אלו קשרי מימן. בין A ל-T יש 2 קשרים, ובין C ל-G יש 3 קשרים, ולכן קשה יותר להפריד מולקולה המכילה יותר קשרי C-G מאשר קשרי A-T. אורך הקשר הוא 1.08 ננומטר.